tag:blogger.com,1999:blog-54931630098589644892024-03-19T02:54:56.408-07:00metaBLOGismoMario Toubeshttp://www.blogger.com/profile/14027769200615990756noreply@blogger.comBlogger7125tag:blogger.com,1999:blog-5493163009858964489.post-77076054395323181982012-11-02T01:56:00.000-07:002012-11-02T01:56:48.279-07:00Dra. S. cerevisae, oncóloga<table align="center" cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="float: left; margin-right: 1em; text-align: left;"><tbody>
<tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjYGz4Hel4g989i2JzOs1E2r5D2_cFmbvwp-qrDbl-evexrmSIe8pBi4KIJt3EkQpYoJdNdYWxb-3pV7Jf5isPscg8oPRjVVtlY7WZTBeN90XEuwAMtrRiSlcfJ_g2qBJAS_klwyBHkyI5n/s1600/Taxus_brevifolia,_Cone,I_SB42577.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" height="200" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjYGz4Hel4g989i2JzOs1E2r5D2_cFmbvwp-qrDbl-evexrmSIe8pBi4KIJt3EkQpYoJdNdYWxb-3pV7Jf5isPscg8oPRjVVtlY7WZTBeN90XEuwAMtrRiSlcfJ_g2qBJAS_klwyBHkyI5n/s200/Taxus_brevifolia,_Cone,I_SB42577.jpg" width="133" /></a></td></tr>
<tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><i>Taxus brevifolia</i></td></tr>
</tbody></table>
<br />
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
El <b>taxol</b>, comercializado bajo el nombre comercial de Paclitaxel® es un
terpenoide (biomoléculas derivado del isopreno obtenido por primera vez de una
especie de tejo, llamado <i>Taxus brevifolia</i>. Es una biomolécula altamente funcionalizada lo que
dificulta en gran medida su síntesis por métodos exclusivamente químicos, por
lo que es necesario partir de intermediarios de su ruta biosintética u otros
metabolitos similares conocidos como <b>taxoides</b>.
El principal problema que presenta este compuesto activo es la baja
concentración que se presenta en el extracto de la corteza del tejo,
incrementando en gran medida los gastos de purificación, además de necesitar
grandes cantidades de la corteza del árbol para obtenerlo. Además se ha visto
que varios hongos endofíticos (se desarrollan junto al tejo) son también
capaces de producir taxol, pero a concentraciones mucho más bajas.</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
El proceso biosintético del taxol
es muy complejo e involucra la acción de 19 enzimas partiendo de un
intermediario común como geranilgeranil difostato. Varios de los genes
codificantes de estas enzimas ya han sido indentificados y purificados, pero otros
no, por lo que no se puede reconstruir la ruta por completo. El punto clave en
la ruta de este fármaco es llevado a cabo por la enzima taxodieno sintasa,
encargada de provocar una triple ciclación originando el
taxa-4(5),11(12)-dieno. A partir de este metabolito se producen varias
oxigenaciones llevadas a cabo por enzimas de la familia de los citocromos P450,
monooxigenasas, que producirán finalmente el tan deseado taxol. </div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="float: right; margin-left: 1em; text-align: right;"><tbody>
<tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjab54oPOqI4g3ao7w847Zin8sAAccBZU5TjvYEC2U6WDuUREdfSnbYlXjKiW1Eg8pPOnq1xjg8O-oq2rkhR8ANIIZmVxOVWyQiUJ8KyQ8Ht2jAs4e5k2mSaSWXsLuctKtvcJgDyGEbyMPu/s1600/C0051658-_Sulfolobus_acidicaldarius_-SPL.jpg" imageanchor="1" style="clear: right; margin-bottom: 1em; margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" height="320" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjab54oPOqI4g3ao7w847Zin8sAAccBZU5TjvYEC2U6WDuUREdfSnbYlXjKiW1Eg8pPOnq1xjg8O-oq2rkhR8ANIIZmVxOVWyQiUJ8KyQ8Ht2jAs4e5k2mSaSWXsLuctKtvcJgDyGEbyMPu/s320/C0051658-_Sulfolobus_acidicaldarius_-SPL.jpg" width="231" /></a></td></tr>
<tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><i>Sulfolobus acidocaldarius</i></td></tr>
</tbody></table>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
A la hora de aplicar ingeniería
metabólica sobre la ya famosa <i>Saccharomyces
cerevisiae</i> nos encontramos con bajas concentraciones de geranilgeranil
difosfato (GGPP), lo que hará que no aparezca residuo alguna de taxadieno pese
a introducirle las enzimas de la ruta biosintética. Para solucionar este
problema es opta por transformar el microorganismo con <b>geranilgeranil disfosfato sintasa<i>
</i></b>de dos organismos diferentes, de <i>Taxus
chinensis</i> (una planta) y de <i>Sulfolobus
acidocaldarius</i> (una arquea acidófila y termófila). Para ello se clonaron
estos dos genes en plásmidos pVV200. Por otro lado, se transformó también con
el plásmido pVV214 con el gen de la <b>taxadieno
sintasa</b> de <i>T. chinensis</i>, el
problema es que al proceder de un organismo tan alejado evolutivamente hablando
es que, pese a que el código genético (es decir, la relación entre los
nucléotidos de DNA y los aminoácidos de la proteína a la que codifica) es el
mismo, no todos los organismos tienen la misma concentración de aminoácidos en
el citoplasma de sus células disponible para la síntesis de proteína, lo que
dificulta la expresión de ciertos péptidos, si un aminoácido es particularme abundante en la proteína y escaso en la célula hospedadora. Así que para solucionarlo se hace
un “apaño” es decir, se modifican ciertos codones para que sean más acordes con
el uso de codones de la propia célula que va a expresar la proteína. Toda esta parrafada anterior viene a que se
hace también una versión más compatible de la taxadieno sintasa y se introduce
también en el vector pVV214. Se observó que pese a que la taxadieno sintasa de <i>T. chinensis</i> carecía de la secuencia que
la mandaba a los plastos la cantidad de GGPP que se producía era muy baja por
sí misma, por lo que con el mismo promotor, llamado PGK y activado por glucosa,
la geranilgeranil difosfato sintasa, ya se conseguía acumular una cantidad
significativa de taxadieno.</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="float: left; margin-right: 1em; text-align: left;"><tbody>
<tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEheDZDnDaHGBAKRsW_umsWGl2kWEYqOP7GRNmswPadZvDrCv2oSFr6HfVSUb9mczZzzSxF20H8Y-vNJjQW_7cBImTo8ItQcFTrNwxnE7xdOONFOi_ry5fXDxyALQM3wXDbxqi92weGMUxPP/s1600/S_cerevisiae.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" height="126" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEheDZDnDaHGBAKRsW_umsWGl2kWEYqOP7GRNmswPadZvDrCv2oSFr6HfVSUb9mczZzzSxF20H8Y-vNJjQW_7cBImTo8ItQcFTrNwxnE7xdOONFOi_ry5fXDxyALQM3wXDbxqi92weGMUxPP/s200/S_cerevisiae.jpg" width="200" /></a></td></tr>
<tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><i>Saccharomyces cerevisiae</i></td></tr>
</tbody></table>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Se hace también una versión
truncada (a la que le falta un fragmento) de una proteína propia de <i>S. cerevisiae</i> llamada <b>3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa </b>y
que se llamará tHMG-CoA reductasa y que será codificada por el gen tmhgr, que
es clonada en el plásmido pVV200.</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
La levadura se transformó usando
el método del acetato. No se observó que la expresión de los genes exógenos
provocara ningún problema a la levadura. </div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Se sabe que en <i>S. cerevisiae</i> se acumula el farnesil
difosfato, un precursos de nuestro taxadieno, pero que en la levadura se usa
para la producción de esteroles (sustancias con diferentes funciones y que
tiene miembros muy conocidos, como el colesterol), aunque también
minoritariamente para la síntesis de otras clases de biomoléculas. En la ruta
del farnesil difosfato aparece una proteína llamada <b>3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa</b>. Se hace también una
versión truncada, es decir que le falta un fragmento correspondiente al extremo
N-terminal y que es un dominio regulatorio, provocando la inhibición de la
proteína en ciertas situaciones. Esta modificación hace que no se bloquee su actividad, aumentando la disponibilidad
del metabolito necesario para la síntesis de la biomolécula de nuestro interés.
Esta proteína se codifica por un gen llamado thmgr (3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA
reductasa truncada). Con esta aproximación se observó un incremento de la
producción del taxadieno de un 50% respecto a la producción con sólo las dos
proteínas vegetales.</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Pero no todo queda aquí, sino que
se les ocurre una nueva mejora, con un redirección del flujo de carbono,
disminuyendo el paso por la ruta de los esteroides. Se sabe que la levadura en
condiciones aeróbicas no es capaz de asimilar los esteroides suplementados en
el medio, hecho conocido como <b>exclusión
aeróbica de esteroles</b>. Este efecto se produce porque en presencia de
oxígeno los citocromos P450 con actividad monooxigenasa están inactivos, por lo que no se pueden sintetizar nuevos esteroles. Este
proceso se regula por un gen llamado UPC2. Existe un variante de este gen,
conocido como <b>UPC2.1</b>, cuya proteína
permite la absorción de estas sustancias en condiciones aeróbicas. Se introduce
este gen porque bastante le cuesta a la pobre célula la síntesis esteroles,
necesarios para ella, como para encima darle caña en forma de taxadieno. </div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Identificando los niveles de
proteína de la geranil geranil difosfatos sintasa se ve que son bajos,
probablemente asociado a la diferencia en el uso de codones. Para solucionarlo
se buscan análogos de esta proteína en otros organismo y se llega a uno en <i>Sulfolobus acidocaldarius</i>, pero que usa
como sustrato dimetilalil difosfato, lo que permite aumenta la expresión de
geranil geranil difosfato por dos lados diferentes sin que se hagan competencia
por el sustrato las enzimas. La expresión de este gen, además del resto ya
introducidos provocó una leve subida en la producción de taxol, pero un gran
incremento de <a href="http://www.pendejaditas.com/wp-content/uploads/2010/09/Its-a-trap.jpg">geranilgeraniol </a>(CUIDADO, QUE ESTE ES DIFERENTE…). Analizando estos datos encontramos que el cuello de botella, es decir,
la reacción limitante es el paso a taxadieno.</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Pues mira, ya que nos hemos
propuesto empetar a nuestra levadura, pues vamos a coger y a mejorar la última
enzima, pero, ¿cómo? Fácil, pues cogemos la taxadieno sintasa y vemos que es
rica en arginina, un aminoácido bastante raro, pues las sustituimos por otros
aminoácidos y como resultado obtenemos un incremento en la producción de
taxadieno de… ¡¡40 veces!!</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Como podemos ver el trabajo tiene
su recompensa y el haber trabajado tanto sobre esta levadura, hemos conseguido
una producción importante de un precursor de una sustancia que puede salvar
muchas vidas.</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<b><span lang="EN-US">Fuente</span></b><span lang="EN-US">: Metabolic engineering of taxadiene
biosynthesis in yeast as a first step towards Taxol (Paclitaxel) production.
Benedikt Engels et al. <i>Metabolic
Engineering</i> 10 (2008)<o:p></o:p></span></div>
Mario Toubeshttp://www.blogger.com/profile/14027769200615990756noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5493163009858964489.post-14088800900973362472012-10-29T02:07:00.000-07:002012-10-29T02:55:54.636-07:00¡¡Syne!! Anda y súbeme una de butanol<table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="float: right; margin-left: 1em; text-align: right;"><tbody>
<tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgxJvt4f12MAWxFo8Gfbpc040EUi0z0JOmK44RzpL85uRF-lMZN6_zYZbILcpA5NRyy21zp6gO0BuuGcGXgnKlcqA2dQ4p4Q16kXShDdeJcqGsLgmcNgYfhcHHMp-76dZerPKn-cGhIXNbI/s1600/synechococcus+elongatus.jpg" imageanchor="1" style="clear: right; margin-bottom: 1em; margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" height="127" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgxJvt4f12MAWxFo8Gfbpc040EUi0z0JOmK44RzpL85uRF-lMZN6_zYZbILcpA5NRyy21zp6gO0BuuGcGXgnKlcqA2dQ4p4Q16kXShDdeJcqGsLgmcNgYfhcHHMp-76dZerPKn-cGhIXNbI/s200/synechococcus+elongatus.jpg" width="200" /></a></td></tr>
<tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><i>Synechococcus elongatus</i></td></tr>
</tbody></table>
<br />
<div class="MsoNormal">
<div style="text-align: justify;">
En un post anterior (<a href="http://metablogismo.blogspot.com.es/2012/09/como-hacer-una-bacteria-borracha-o.html">éste</a>) hablaba de la
producción de un biocombustible como es el etanol, pues bien en este otro
hablaremos de otro: el <b>1-butanol</b>.
Este compuesto se puede utilizar como base de partida para la obtención química
de varios productos, pero más importante que eso es que tiene capacidad para
almacenar energía y luego ser usada como combustible, ya que es muy similar a
la gasolina. Para producirlo, metabólicamente hablando, hay dos formas: la ruta
sintética de los 2-cetoácidos, o bien la dependiente de coenzima A (CoA). </div>
</div>
<div class="MsoNormal">
<div style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div style="text-align: justify;">
En este trabajo se usa una <b>cianobacteria</b> llamada <i>Synechococcus
elongatus</i> y de las estrategias que he mencionado el grupo opta por la
segunda ruta y, para ello, le introducen la friolera de… ¡¡5 GENES!! Estos
genes son <i>hbd</i>, <i>crt</i> y <i>adh2</i> del ya
mencionado <i>Clostridium acetobutylicum</i>,
el gen <i>ter</i> de <i>Tremponema denticola </i>y el gen <i>atoB
</i> de <i>Escherichia coli</i>. </div>
</div>
<div class="MsoNormal">
<div style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div style="text-align: justify;">
Para introducir los genes a la <b>cianobacteria</b> se usan plásmidos que recombinan, es decir que se
insertan, dentro del genoma del microorganismo. Además, para evitar que se
produzcan disrupciones de genes y “daños colaterales” no deseados hay dos sitios
caracterizados en los cuales se pueden llevar a cabo estos procesos inocuamente
y que se conocen como “sitios neutral I” y “sitio neutral II”. Estos plásmidos,
para construirse y luego ser transformados en nuestro microorganismo, se
desarrollan en <i>E. coli.</i> Como 5 genes
en un único plásmido es demasiado deciden distribuirlos en dos plásmidos
diferentes, que se llamarán pEL5, que se dirigirá hacia el NSI y contendrá los
genes <i>atoB </i>y <i>adhE2</i> , y pEL14 que se dirigirá hacia el NSII y que llevará los
tres restantes genes. Cada uno de los plásmidos conferirá asimismo una resistencia
diferente, siendo el primero a espectinomicina y el segundo a kanamicina.
Además el <i>ter </i>de <i>T. denticola</i> se modifica, añadiendo lo que se conoce como cola de
polihistidinas. Esta modificación tiene como función el ser reconocida por un
anticuerpo, lo que luego nos permitirá identificarla al unírselo. Para expresar
estos genes se sitúan bajo promotores inducibles (es decir, la expresión se da
bajo ciertas condiciones) en este caso inducibles por lactosa. </div>
</div>
<table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="margin-left: auto; margin-right: auto; text-align: center;"><tbody>
<tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEidSmN45-PCI9gi1kUi7ySyD3n6BPyvkpLo11uNxQNl69Axw-5qL6EkhNwH-WSvfwT03Em4rwchTWghKNma6VOK_B_yObjdT1a8xIyrJzcPY1X_6UrAMFB7E5sZ423Dejky3yX9DFCTsWK8/s1600/ruta.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" height="117" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEidSmN45-PCI9gi1kUi7ySyD3n6BPyvkpLo11uNxQNl69Axw-5qL6EkhNwH-WSvfwT03Em4rwchTWghKNma6VOK_B_yObjdT1a8xIyrJzcPY1X_6UrAMFB7E5sZ423Dejky3yX9DFCTsWK8/s400/ruta.jpg" width="400" /></a></td></tr>
<tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">Ruta metabólica introducida</td></tr>
</tbody></table>
<div class="MsoNormal">
<div style="text-align: justify;">
<br /></div>
</div>
<div class="MsoNormal">
<div style="text-align: justify;">
Para transformar a <i>S.
elongatus </i> se deja que el cultivo se
esté desarrollando en fase exponencial (es decir, cuando más crece) y entonces
se le añade el DNA exógeno que queremos que incorpore, dejándolo todo la noche
a oscuras para que se dé a cabo la asimilación. Posteriormente, para
seleccionar aquellos individuos que lo han introducido satisfactoriamente se
añaden dos antibióticos que actúan como marcadores y que son la espectinomicina
y la kanamicina, como ya mencionamos antes, y se siembra en placa. Cuando
aparecen las colonias se “pican”, es decir, se toma parte y se analiza por PCR
para ver si se ha producido la inserción de los fragmentos de interés. Una vez
demostrada esta inserción se toma una de las colonias para continuar con los
experimentos. </div>
<div style="text-align: justify;">
<br /></div>
</div>
<div class="MsoNormal">
<table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="float: left; text-align: justify;"><tbody>
<tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEi_XowW2OfhDEWxh0jL71Ttb7HY1J9RxikdYqYvSf3Vb3h-6JNuhXGhyphenhyphen7qVfjMkx_Y8oOIfb97feiEX8HzYPuxPMXEC__l9W3Nip2AxzO8BX1OELbGK3NOzaORD7iBCUWaivR49igrkux96/s1600/Synechococcus-Elongatus-in-Petri-Dish.jpg" imageanchor="1" style="clear: right; margin-bottom: 1em; margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" height="133" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEi_XowW2OfhDEWxh0jL71Ttb7HY1J9RxikdYqYvSf3Vb3h-6JNuhXGhyphenhyphen7qVfjMkx_Y8oOIfb97feiEX8HzYPuxPMXEC__l9W3Nip2AxzO8BX1OELbGK3NOzaORD7iBCUWaivR49igrkux96/s200/Synechococcus-Elongatus-in-Petri-Dish.jpg" width="200" /></a></td></tr>
<tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">Colonias de <i>S. elongatus </i>en placa de Petri</td></tr>
</tbody></table>
<div style="text-align: justify;">
El siguiente paso consiste en el cultivo en medio líquido en
botellas con tapón de rosca de 250ml. Las condiciones para el cultivo son con, para que sea un cultivo aeróbico, o
sin un burbujeo constante de una mezcla gaseosa de 5% CO<sub>2</sub>/95% N<sub>2</sub>.
Cómo podemos ver, son condiciones anaeróbicas, es decir, no hay oxígeno. Para
inducir la expresión de los genes se usa un reactivo conocido como IPTG, una
sustancia análoga a la lactosa y que es capaz de activar la expresión de los
genes situados bajo promotores inducible por el mencionado azúcar y que además presenta la ventaja de que no puede ser metabolizado como fuente de carbono, lo que hace que quede en el medio de cultivo activando la expresión.</div>
</div>
<div class="MsoNormal">
<div style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div style="text-align: justify;">
Estudiaron la producción del 1-butanol en diferentes
condiciones</div>
</div>
<div class="MsoNormal">
</div>
<ul>
<li style="text-align: justify;"><span style="text-indent: -18pt;">Con presencia de oxígeno y luz constante y no se
observó nada de producción del mencionado biocombusible.</span></li>
<li style="text-align: justify;"><span style="text-indent: -18pt;">Con burbujeo constante de 5 CO</span><sub style="text-indent: -18pt;">2</sub><span style="text-indent: -18pt;">%/95%
N</span><sub style="text-indent: -18pt;">2</sub><span style="text-indent: -18pt;"> buscando la purgación de todo el oxígeno y con iluminación,
produciéndose unas cantidades ínfimas de 1-butanol.</span></li>
<li style="text-align: justify;"><span style="font-family: Symbol; text-indent: -18pt;"><span style="font-family: 'Times New Roman'; font-size: 7pt;"> </span></span><span style="text-indent: -18pt;">El siguiente paso consistió en incubar en
oscuridad, además de con el que burbujeo, con esto se consigue eliminar
completamente el oxígeno, ya que al no producirse la fotosíntesis no se
acumula. El resultado fue que se llegaron a producir cantidades significativas
de butanol.</span></li>
</ul>
<div class="MsoNormal">
<div style="text-align: justify;">
Estos resultados hacen creer que el oxígeno es un inhibidor
de la producción del alcohol. Para comprobrar esta tesis, se utilizó un
reactivo llamado 3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetilurea (reconocedlo, ya echabáis
de menos los nombres complicados. Bueno, pues aquí os van las siglas, desde
siempre haciendo las cosas más fáciles: DCMU) que es un inhibidor del
fotosistema II (PSII), bloqueando la capacidad de la cianobacteria de producir
el O<sub>2</sub>. Este compuesto se
añadió a cultivos que se sometieron a condiciones óxicas y anóxicas y con
diferentes concentraciones del DCMU. La condición de oscuridad es dejó como
control, sin que se añadiese el inhibidor, total, no hace falta, en oscuridad
no se produce oxígeno. El resultado fue que a mayores concentraciones de DCMU
en condiciones anóxicas se acumulaba mayor concentración de 1-butanol. La
conclusión de esto es clara: no es la luz la que bloquea la producción del
alcohol, sino la presencia de oxígeno. </div>
<div style="text-align: justify;">
<br /></div>
</div>
<div class="MsoNormal">
<div style="text-align: justify;">
Concluyendo, como podemos ver no sólo en las bacterias está
el futuro de la energía, sino que las microalgas tienen mucho que decir en este
campo, siendo capaces de nutrirse del CO<sub>2</sub> del aire, que tan
contaminante se llega a considerar y darnos como resultado productos que no
resultan tan interesantes como el 1-butanol. Además gracias a este artículo se
va que la producción del alcohol butílico está influido para la presencia de
oxígeno, por lo que el paso a nivel industrial requerirá de adaptación a dicha
condición. </div>
</div>
<div class="MsoNormal">
<div style="text-align: justify;">
<br /></div>
</div>
<div class="MsoNormal">
<div style="text-align: justify;">
<span lang="EN-US">Fuente:
Metabolic engineering of cyanobacteria for 1-butanol production form carbon
dioxide. Ethan I. Lan et al<i>. Metabolic
engineering </i>13 (2011)<o:p></o:p></span></div>
</div>
Mario Toubeshttp://www.blogger.com/profile/14027769200615990756noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5493163009858964489.post-88411661318406502342012-10-24T01:10:00.000-07:002012-10-24T04:27:50.282-07:00¡Hya!¡Fusión! o de cómo fusionar dos hongos (y sus respectivos metabolismos)<br />
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Uno de los mayores problemas a
los que se enfrentan los ingenieros ambientales, los ingenieros químicos, los
microbiólogos y demás profesionales que trabajan con residuos y contaminación,
es la presencia de ciertas sustancias conocidas como <b>recalcitrantes</b>, es decir, difíciles de degradar. Una de estas
sustancias <b>xilano</b> es el que aparece
como parte de los residuos procedentes de los vegetales, como las maderas, y
que forman parte de los conocidos como residuos lignocelulósicos. Para resolver
el problema de su difícil procesado hasta ahora se hacían tratamientos
químicos, caros y altamente contaminantes, pero ha aparecido una solución: el
tratamiento enzimático.<br />
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="float: right; text-align: left;"><tbody>
<tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgvN1-KAFqPZDJ2xHuKzo5FCs1EVGbIB11F-D_198SOL4Yai48BjBl-0wPiA7ibRenJr1a51XCwJ-ULwIBMfwBel0d9HGxhJ8Rd4lvExkv18MT0LW3CgzpDojIU7aIBq8PdY-ePa-je63g_/s1600/spombe.jpg" imageanchor="1" style="clear: left; margin-bottom: 1em; margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" height="200" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgvN1-KAFqPZDJ2xHuKzo5FCs1EVGbIB11F-D_198SOL4Yai48BjBl-0wPiA7ibRenJr1a51XCwJ-ULwIBMfwBel0d9HGxhJ8Rd4lvExkv18MT0LW3CgzpDojIU7aIBq8PdY-ePa-je63g_/s200/spombe.jpg" width="200" /></a></td></tr>
<tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><i>Schizosaccharomyces pombe</i></td></tr>
</tbody></table>
Hay dos tipos de enzimas que
atacan a los xilanos, la endo-β-xilanasas y las β-D-xilosidasas.
El xilano pertenece a la familia de los <b>polímeros</b>,
es decir, moléculas formadas por la repetición de moléculas más sencillas,
conocidas como <b>monómeros</b>. La misión
de estas enzimas consiste en dejar al descubierto los azúcares (sus monómeros)
que forman el xilano para que puedan ser utilizados para ser fermentados, lo
cual se conoce como sacarificación). Por tanto, nos encontramos ante un
proceso, que está actualmente muy de moda conocido como <b>sacarificación y fermentación simultánea</b>. Además las levaduras son
preferidas sobre las bacterias para trabajar en la industria por sus resistentes
paredes celulares y su gran tamaño, lo que las hace más resistentes a emborr…
digo al etanol.<br />
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="float: left; text-align: right;"><tbody>
<tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjeKsl0lHajlvuphdselGbGVCMb9M8ZiOV4OWcBDrzMoGJ_KNRKCTLQvAGziotBsYtaiM-nDmyD_eIinQM1pIirKdj0MfNHT8JAVSzb3R6R33wF92twj7xUePd1E776WY6o8f_PIuUXh6xA/s1600/shiitake.jpg" imageanchor="1" style="clear: right; margin-bottom: 1em; margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" height="141" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEjeKsl0lHajlvuphdselGbGVCMb9M8ZiOV4OWcBDrzMoGJ_KNRKCTLQvAGziotBsYtaiM-nDmyD_eIinQM1pIirKdj0MfNHT8JAVSzb3R6R33wF92twj7xUePd1E776WY6o8f_PIuUXh6xA/s200/shiitake.jpg" width="200" /></a></td></tr>
<tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><i>Lentinula edodes</i></td></tr>
</tbody></table>
En este caso se decide aplicar
una estrategia muy arriesgada: <b>la fusión
de protoplastos </b>(células que no poseen pared celular). Esta técnica
consiste en juntar dos células de organismos diferentes y fusionarlas,
literalmente, para generar un nuevo organismo que tendrá características de
ambos, como los metabolismos, que se entrelazan pudiendo degradar diferentes
sustratos o generar nuevos productos. Los organismos que se deciden fusionar
son por un lado la levadura <i>Schizosaccharomyces
pombe</i>y la seta (qué
poco científico soy a veces) <i>Lentinula
edodes</i>.</div>
<br />
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="float: right; text-align: left;"><tbody>
<tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgKK0l9O8lpOUOlLN5UGJ7NWl6NlIITaYqSTCMfHDA8JNx-ZfYUFLFyIPVaxeA7yZOOKK1HVpb3SVxtVSXZs-rli0d_2ZrLQsEStWBqUWy6EFuH0C_9Rgivbef9zvle30P6DWA7GmZgUwdH/s1600/pellet.jpg" imageanchor="1" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" height="150" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgKK0l9O8lpOUOlLN5UGJ7NWl6NlIITaYqSTCMfHDA8JNx-ZfYUFLFyIPVaxeA7yZOOKK1HVpb3SVxtVSXZs-rli0d_2ZrLQsEStWBqUWy6EFuH0C_9Rgivbef9zvle30P6DWA7GmZgUwdH/s200/pellet.jpg" width="200" /></a></td></tr>
<tr><td class="tr-caption" style="font-size: 13px; text-align: center;">Esto es un pellet</td></tr>
</tbody></table>
Para la fusión de
protoplastos se cultivaron por un lado la <i>S.
pombe </i>durante 48 horas a 30ºC y se trataron con un extracto de un hongo
productor de enzimas que rompen la pared celular. Las setas de <i>L. edodes</i>, por otro lado se
diseccionaron hasta dejar fragmenos pequeños y se incubaron a 30ºC para que se
acostumbrara a la temperatura de desarrollo de la levadura. El paso siguiente
es sembrar en placa de Petri y de ahí tomar muestras, centrifugarlas por
separado, para que se nos queden las células en forma de <b>pellet </b><b><i> </i></b>en el fondo del
eppendorf. De ahí añadimos de nuevo el extracto de enzima degradadora de pared
que hablamos y tratamos ambas muestras. Así es cómo se generan los <b>protoplastos</b>.<br />
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br />
<table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="float: left; margin-right: 1em; text-align: left;"><tbody>
<tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhLVpj6pOFPv4IHalW-5Gck8aLGk4ny8zrRmcq8R6IxKDOrhwCpwNObMMDiTUvMwT6W01rvjGgxyBtuGoM9wpttvNNjhnEVrInqXDxbpZtAAc1FfotnGU-hoAi-vDTxKOf-cHCFJHqGeZiR/s1600/fusi%C3%B3n.jpg" imageanchor="1" style="clear: right; margin-bottom: 1em; margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" height="320" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhLVpj6pOFPv4IHalW-5Gck8aLGk4ny8zrRmcq8R6IxKDOrhwCpwNObMMDiTUvMwT6W01rvjGgxyBtuGoM9wpttvNNjhnEVrInqXDxbpZtAAc1FfotnGU-hoAi-vDTxKOf-cHCFJHqGeZiR/s320/fusi%C3%B3n.jpg" width="151" /></a></td></tr>
<tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;">Comparación entre la levadura, <br />
el hongo y el fusante</td></tr>
</tbody></table>
Llega el momento de hacerlos
fusionar. Para ello se hace una mezcla 1:1 de los dos tipos celulares, es
decir, el mismo número de células de cada especie. Se mezclan y se centrifugan
de forma que quede un pellet. Se le añade una solución que contiene PEG (sé qué
en vuestra cabeza está sonando lo siguiente “PEG, PEG… ¿de qué me suena?”. Pues
coged, dejad el ordenador, id al baño y mirad la etiqueta del gel, o del
champú… o de cualquier producto de higiene) o polietilenglicol, una sustancia
que fluidiza las membranas. Tras esto se centrifuga y se siembra en un hueco
que se hace en una placa con agar especial, conocido como agar de regeneración.
Se añade otra capa de este agar formando una especie de sándwich de
protoplastos (reconoced que queréis probarlo vosotros también). Se dejan que
crezcan a 30ºC durante 2-3 días y después con un microscopio se seleccionan y
se vuelven a sembrar. Se repite este ciclo diez veces, para asegurarnos que
tenemos células estables, que llamaremos <b>fusantes</b>.
Se observa que la morfología de estas células nuevas no corresponde con las
anteriores, ya que parecen levaduras elongadas, pero que se unen formando
pseudomicelios, como haría una hongo. <br />
<br />
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Ya tenemos nuestro nuevo
organismo, y ahora lo que queremos es analizar dos cosas: por un lado la
capacidad que tiene de asimilar diferentes fuentes de carbono y, por otro lado,
que capacidad tiene para la síntesis de polioles. Se usaron 28 fuentes de
carbono distintas en este estudio y se observó que la levadura inicial podía
usar 8 de ellas, mientras que el fusante podía usar las 28. Además con 15 de
ellas podía generar gases, mientras que la levadura sólo podía usar 5. Se
centraron particularmente en tres fuentes de carbono: glucosa, xilano y xilosa.
<br />
<br /></div>
<div class="MsoListParagraphCxSpFirst" style="margin-left: 38.5pt; mso-add-space: auto; mso-list: l0 level1 lfo1; text-align: justify; text-indent: -18.0pt;">
<!--[if !supportLists]--><span style="font-family: Symbol; mso-bidi-font-family: Symbol; mso-fareast-font-family: Symbol;">·<span style="font-family: 'Times New Roman'; font-size: 7pt;">
</span></span><!--[endif]-->En el caso de la <b>glucosa</b> se alcanzó una concentración de biomasa (la masa que
presentan las células) de 20.12 g/L. Además, sorprendentemente… se produjo
etanol, hasta una concentración de unos 80 g/L. También, ya que el bicho estaba
por sorprender, a partir del sexto día comenzó a producir <b>arabitol</b>, hasta unos límites de 8.56 g/L.</div>
<div class="MsoListParagraphCxSpLast" style="margin-left: 38.5pt; mso-add-space: auto; mso-list: l0 level1 lfo1; text-align: justify; text-indent: -18.0pt;">
<!--[if !supportLists]--><span style="font-family: Symbol; mso-bidi-font-family: Symbol; mso-fareast-font-family: Symbol;">·<span style="font-family: 'Times New Roman'; font-size: 7pt;">
</span></span><!--[endif]-->La <b>xilosa</b>,
por otro lado, al ser usada como fuente de carbono permitió alcanzar un nivel
de biomasa de 18.23 g/L, ligeramente menor que el conseguido con glucosa. Como
consecuencia del metabolismo de esta sustancia se produce <b>xilitol</b>, un poliol usado como edulcorante, pero tras pasar un
tiempo se comienza a consumir. Por otro lado, también se produce <b>arabitol</b>, alcanzando valores que rondan
unos 19 g/L.<br />
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Pero el punto más fuerte de este
experimento es el uso de <b>xilano</b>, una
sustancia recalcitrante como ya dije y, por tanto, difícilmente degradable. Nuestro
fusante es capaz de romper estos enlaces (hidrolización) para obtener la xilosa
y usarla como fuente de carbono para alimentarse. Usando esta fuente de carbono
alcanza unos valores similares a los que se mencionó antes, es decir, unos
18.10-18.40 g/L. Se produce arabitol hasta alcanzar una cota de 63.78 g/L
(vamos, lo que viene a ser un pasote) y de xilitol superando los 60 g/L
también, pero, como todo en esta vida, no todo va a ser un campo de rosas, y
obtenemos una producción nula de etanol.<br />
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Complementariamente a este último
experimento se indagó si sería el fusante capaz de utilizar como fuente de
carbono residuos agrícolas, como restos de maíz o de arroz, obteniendo un rendimiento
similar al anteriormente mencionado<br />
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Concluyendo… este bicho, este
híbrido interespecífico ha venido al mundo a revolucionarlo. Come de todo lo
que le echen y encima, nos produce sustancias de interés, polioles. Oye, ¿qué
queréis que os diga? Yo me lo quedo.<br />
<br />
<br />
<div class="MsoNormal">
<span lang="EN-US">Fuente: Construction
of an intergeneric fusion from <i>Schizosaccharomyces pombe </i>and <i>Lentinula
edodes </i>for xylan degradation and polyol production. Cheng-Chang Lin et al. <i>Enzyme and microbial technology </i>(2005)<o:p></o:p></span></div>
</div>
Mario Toubeshttp://www.blogger.com/profile/14027769200615990756noreply@blogger.com3tag:blogger.com,1999:blog-5493163009858964489.post-9499759480248690342012-10-02T03:49:00.003-07:002012-10-24T04:26:11.906-07:00Superproducción de L-fenilalanina en B. subtilis<br />
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Quizás hayamos escuchado alguna
vez el concepto “<b>aminoácido esencial</b>”
sin saber realmente qué es eso. Pues bien, esta clase de sustancias son los
aminoácidos que el propio organismo no puede sintetizar por no poseer las rutas
biosintéticas que llevan hasta la producción de dicho metabolito, pero que le
son necesarios. Como podemos suponer de dicho enunciado, la esencialidad o no
esencialidad depende del propio organismo y no es un hecho general para toda la
variedad de la vida. La única vía que tenemos para tener estas sustancias es a
través de la dieta. Uno de estos aminoácidos es la L-fenilalanina, un
aminoácido aromático que actúa de precursor para otro, la tirosina. ¿Cómo
hacemos para obtenerlo en grandes cantidades?</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
La estrategia que se ha utilizado
para este experimento es diferente al resto, ya que buscamos, en este caso, la
sobreexpresión de una proteína en concreto. Aquí será la <b>corismato mutasa</b>, (en la ruta metabólica está recuadrada en verde
en esta <a href="http://yfrog.com/obxkohuj">imagen</a>) codificada por el gen <b>aroH</b>, presente en el propio genoma de <i>Bacillus subtilis</i>, entonces la pregunta
es: ¿para qué hacer esto?</div>
<div class="separator" style="clear: both; text-align: center;">
</div>
<br />
<table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="float: left; margin-right: 1em; text-align: left;"><tbody>
<tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiNnGKIqXMlD7RnMA2jm4AUpyHTVOFwZM6oae0GC15wUitfkXyQWL8TxPbzTnIxlp-GDx1LKFbrJI0o94tlShraWYEZbZ8xhCIXTLUvbsPup9PwzRHrQoxTIlg9PyO494iZIsYqKAou2xBN/s1600/bsubtilis.jpg" imageanchor="1" style="clear: left; margin-bottom: 1em; margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" height="150" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiNnGKIqXMlD7RnMA2jm4AUpyHTVOFwZM6oae0GC15wUitfkXyQWL8TxPbzTnIxlp-GDx1LKFbrJI0o94tlShraWYEZbZ8xhCIXTLUvbsPup9PwzRHrQoxTIlg9PyO494iZIsYqKAou2xBN/s200/bsubtilis.jpg" width="200" /></a></td></tr>
<tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><i>B. subtillis</i></td></tr>
</tbody></table>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Pues la respuesta es sencilla, la
bacteria en cuestión produce bajas concentraciones de fenilalanina (Phe), así
que un incremento de la actividad de una de las enzimas que lleva a la
producción de este aminoácido provocará un desequilibrio de la ruta metabólica,
conllevando una acumulación de la sustancia de interés. El método para hacerlo
consiste en clonar el gen aroH en un plásmido <b>multicopia </b>(aparece en número alto de copias del mismo) lo que hará
que incremente la concentración de dicha proteína.</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Para hacer esto, primero es
necesario obtener el ADN de <i>B. subtilis</i>.
Para ello, se rompe la célula (se hace una lisis) partiendo de un cultivo en el
que las células están en buena salud, creciendo exponencialmente. Para obtener
el gen aroH se utiliza la ya mencionada PCR usando primers específicos que
contienen secuencias reconocidas por las enzimas de restricción SalI y BamHI.
Una vez amplificado este gen se introduce en un plásmido, llamado pUC19,
gracias a las dos enzimas de restricción anteriormente mencionadas, para poder
mantenerlo en <i>E. coli</i> que se
manifestará por el desarrollo de la resistencia al antibiótico ampicilina. El
método de transformación es la coprecipitación con CaCl<sub>2, </sub>esta
sustancia se une al ADN cargado negativamente y lo acerca al núcleo del
lipopolisacárido (estos son parte de la pared celular bacteriana, que actúa
como protección), lo que permite que cuando le demos un golpe de calor a la
bacteria pase al interior celular y se lleve a cabo la transformación. Para
poder después transformarlo en <i>B.
subtilis</i>, usando las mismas enzimas de restricción, que usamos en nuestra
bacteria de interés recurrimos a un sistema conocido como “shuttle vector” o <b>vector lanzadera</b>, llamado pMK4, el cual
nos permitirá el cultivo en los dos microorganismos, además podremos
seleccionar resistentes a dos antibióticos, la ampicilina y el cloranfenicol.
Para transformar al bacilo se usa la electroporación que ya mencioné en el post
anterior. La ventaja que presenta tenerlo en un plásmido multicopia, como es el
caso, es que va a aparecer un mayor número del gen, lo que hará que también sea
mayor la concentración de la proteína. </div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="float: right; text-align: right;"><tbody>
<tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEicuSYE_bEX0k9OD2JQltq1qQinIvO-ZdWHAbuncIUda61-stX95MdtM2-Y1ZjFl8aeM0G_R5dSccdbU4BaFEAUMEYiVxeHEyTXRScmAir31xcuoh-6lhlW48PXDDBfdFeTUq2i3m4ro_rw/s1600/e_coli.jpg" imageanchor="1" style="clear: right; margin-bottom: 1em; margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" height="199" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEicuSYE_bEX0k9OD2JQltq1qQinIvO-ZdWHAbuncIUda61-stX95MdtM2-Y1ZjFl8aeM0G_R5dSccdbU4BaFEAUMEYiVxeHEyTXRScmAir31xcuoh-6lhlW48PXDDBfdFeTUq2i3m4ro_rw/s200/e_coli.jpg" width="200" /></a></td></tr>
<tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><i>E. coli</i></td></tr>
</tbody></table>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Se sabe que la fenilalanina
inhibe en gran medida su propia producción, ya que inhibe a una enzima que
responde al nombre de 3-desoxi-D-arabinoheptulosa-7-fostafo sintasa, que es la
primera enzima que desvía desde la rama principal hacia la síntesis de aminoácidos
aromáticos. Si quieres ver la ruta, pincha <a href="http://yfrog.com/esnsiijj">aquí</a>. Para evitar esta inhibición, se alimentó a las células con dos metabolitos
intermedios de la ruta y que están justo antes de esta enzima, de tal forma que
el equilibrio químico queda desplazado, evitando que se produzca la inhibición.
Estas sustancias son eritrosa-4-fostato y fosfoenolpiruvato (no es quejaréis,
¿eh? Que estas son facilitas). De hecho se observa que al alimentar con estos
dos reactivos aumenta la concentración varias veces.</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Ahora bien, en <i>E. coli</i> y en <i>B. subtilis </i>este aumento de la producción de fenilalanina es
diferente. En el primero microorganismo se da una duplicación de la producción,
menor que en el bacilo porque presenta 3 diferentes DHAP sintasas, cada una
sujeta a inhibición por un aminoácido diferente, siendo casi 3 veces superior
la producción de éste.</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Con estos resultados, hemos visto
que es posible aumentar la producción de uno de los aminoácidos, pero ya
teniendo este nodo controlado… ¿quién sabe si en un futuro no muy lejano
podamos maximizar la producción de los otros dos aminoácidos aromáticos, la
tirosina y el triptófano?</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
P.d. si abrís la imagen veréis
que es una maraña, además, lo más divertido es que en el artículo la llaman la
“ruta simplificada”, qué cachondos…<br />
<br />
<br />
<div class="MsoNormal">
<span lang="EN-US">Metabolic
engineering of aromatic group amino acid pathway in <i>Bacillus subtilis </i>for
L-phenylalanine production I.S. Özçelik et al<i>. Chemical Engineering Science</i>
(2004)<i><o:p></o:p></i></span></div>
</div>
Mario Toubeshttp://www.blogger.com/profile/14027769200615990756noreply@blogger.com1tag:blogger.com,1999:blog-5493163009858964489.post-20359477828140846582012-09-26T05:31:00.001-07:002012-10-29T02:53:47.399-07:00¿Cómo hacer una bacteria borracha o apañar la ruta metabólica de un clostridio para producir etanol?<br />
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Nos encontramos actualmente en
una época en la que se produce una gran demanda de producción de etanol, y pese
al título de la entrada, no para emborrachar bacterias o personas. La necesidad
industrial del etanol en la sociedad actual va para industria, en muy
diferentes campos; uno de los más importantes es la producción de bioetanol,
teniendo en cuenta los problemas con el agotamiento del petróleo del mundo
contemporáneo y su incremento de precio.</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="float: left; text-align: center;"><tbody>
<tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiGCpyTtjZ7rxPyiduYd7WD5GXulwYvJHeTEuEVdMVoRexL4VbkS6DGxnVinbt9UwJBdtmU12VC-lywNkXhfTMdO12vPK-z3rRqRaSQd2zieq5CM02t9FiD98EevEgDIaWpXr3EhYVjkbR5/s1600/saccharomyces.png" imageanchor="1" style="margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" height="131" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiGCpyTtjZ7rxPyiduYd7WD5GXulwYvJHeTEuEVdMVoRexL4VbkS6DGxnVinbt9UwJBdtmU12VC-lywNkXhfTMdO12vPK-z3rRqRaSQd2zieq5CM02t9FiD98EevEgDIaWpXr3EhYVjkbR5/s200/saccharomyces.png" width="200" /></a></td></tr>
<tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><i>Saccharomyces cerevisiae</i></td></tr>
</tbody></table>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Se sabe que el microorganismo más
eficiente en la producción en la producción de este alcohol es la levadura <i>Saccharomyces cerevisae</i>, seguida
por las bacterias del género <i>Clostridium</i>.
Pese a este segundo puesto el uso de estos microorganismos presenta ventajas
sobre el uso de levaduras. La principal es la capacidad que tienen de usar como
sustrato, es decir, como alimento para su desarrollo y la producción de etanol,
azúcares que presentan en su estructura anillos de 5 ó 6 carbonos (pentosas y
hexosas), a diferencia de la levadura, que sólo usa hexosas.</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Los clostridios se caracteriza
por tener un metabolismo fermentativo conocido como <b>bifásico</b>, debido a que se produce en dos tiempos. La primera fase,
de crecimiento, se caracteriza porque el microorganismo toma azúcares del medio
y los metaboliza hasta convertirlo en ácidos como el butírico o el acético, por
lo que se conoce como acidogéneis; mientras que en la segunda fase,
estacionaria, es decir, no se produce un aumento de la población bacteriana, se
producen solventes orgánicos, como la acetona, el etanol y el butanol; esta
parte del metabolismo se conoce como solventogénesis. Estas tres sustancias son
las que dan nombre a la fermentación que producen este generación: la <b>fermentación ABE</b>. Si quieres ver un
esquema de la ruta, pulsa <a href="http://yfrog.com/gy47575554j">aquí</a>.</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Un concepto importante a tener en
cuenta para este post es el <b>flujo de
carbono</b>, es decir, el camino, la ruta por la que va pasando este elemento.
El carbono es igual para todos los metabolitos, pero la célula tiene mecanismos
para dirigirlo hacia unos productos u otros, en función de sus necesidades.
Pues bien, ya sabiendo esto, en el artículo que os voy a ir desgranando en este
post los investigadores buscan redirigir el flujo de carbono hacia el etanol,
en lugar de que se dirija hacia la acetona o los ácidos. Para ello, se pueden
bloquear distintas enzimas para que se dejen de producir metabolitos
indeseados, pero la enzima que se decide atacar es la Hbd o
3-hidroxibutiril-Coenzima A deshidrogenasa que aparece justo después del desvío
de un metabolito intermedio hacia la producción de acetona. Esto hace que sólo
nos queden dos de los tres solventes que mencionamos a la hora de definir la
fermentación ABE, el etanol y la acetona… ¡EA!
(tenía que decirlo).</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Hasta aquí todo muy bien, pero la
pregunta es: ¿cómo se elimina una enzima? O como diría un biotecnólogo: “¿Cómo
se genera un knock-out?”</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Hasta ahora para generar un
knock-out lo que se hacía era eliminar el gen por doble recombinación, que será
contada en otro post, pero este método se ha visto que es poco eficiente para
las bacterias del género <i>Clostridium</i>.
Para ello se diseñó un sistema conocido como ClosTron. En esta aproximación lo
que se hace es introducir en la secuencia especial, el intrón. Esta clase de
regiones de DNA no se traducen a proteína, además, aplicando el sistema del
ClosTron no se introduce exactamente por recombinación entre el DNA del
plásmido en el que va clonado y el cromosoma bacteriano, sino que se da por la
aparición de un RNA intermedio. Esto hace que la eficiencia de la introducción
de la mutación aumente. Pues muy bien, gracias a la introducción de este
fragmento de 69/70 pares de bases (bp), podemos bloquear la expresión del gen
de interés, la Hbd. Este fragmento se clona en un plásmido y se transforma la
bacteria con él utilizando un método conocido como <b>electroporación</b>, que consiste en pegarle un calambrazo a la
bacteria, de tal forma que, momentáneamente, se abren poros en la membrana
bacteriana y el ADN que queremos introducir pasa a la célula. Claro, después de
este “shock” se le dan mimitos, un medio que le guste para crecer y así se
recupera y ya podemos seleccionar las bacterias que hayan introducido nuestro
plásmido. Para hacer esto hay un sistemas “muy apañao” que consiste en que los
plásmidos, además del gen de interés, presentan una gen que les confiere una
resistencia a un antibiótico, así que lo único que se debe hacer es cultivar el
microorganismo en una placa que contenga esta sustancia, así, los que no posean
el plásmido mueren por acción del antibiótico y las colonias que sobreviven son
portadores de nuestro plásmido.</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="float: right; margin-left: 1em; text-align: right;"><tbody>
<tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgNm9hVGUrSWfSPrLdOwrNwX1c679tAFPU_FWk8HF54g3mDAufTFTRUWlAIgIlaJ6ckQDpRfekM06yaa-_HwP5LpOTZcniEfRXNfy3xMtLbWl1T9GpfLXhuq1343hYrctcWZJOc625nJtoN/s1600/clostridium.jpg" imageanchor="1" style="clear: right; margin-bottom: 1em; margin-left: auto; margin-right: auto;"><img border="0" height="108" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgNm9hVGUrSWfSPrLdOwrNwX1c679tAFPU_FWk8HF54g3mDAufTFTRUWlAIgIlaJ6ckQDpRfekM06yaa-_HwP5LpOTZcniEfRXNfy3xMtLbWl1T9GpfLXhuq1343hYrctcWZJOc625nJtoN/s200/clostridium.jpg" width="200" /></a></td></tr>
<tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><i>Clostridium acetobutylicum</i></td></tr>
</tbody></table>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Una vez hecho esto, analizamos la
actividad productora de etanol de nuestro <i>Clostridium
acetobutylicum</i>, se cultivan en modo “batch”, esto es de forma discontinua,
teniendo a nuestra bacteria en un medio líquido sin alimentación hasta que
nosotros queramos o hasta que agote los nutrientes. Si analizamos los
productos, vemos que no aparecen metabolitos 4C (con cuatro carbonos, que
serían el butanol y el butirato, por lo cual podemos concluir que SÍ que se ha
producido una disrupción de la ruta metabólica antes de que se produzcan dichas
sustancias. Pero no todo va a ser tan bonito, se observa a la vez que el
mutante crece a un ritmo más lento que el nativo. </div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Se sabe que la cantidad de
glucosa en el medio es el factor limitante para la producción de etanol, por lo
que deciden hacer una mejora en el sistema anterior de cultivo, alimentándolo
con glucosa y evitar así el agotamiento de este sustrato. Con este método se
observa que el crecimiento del microorganismo es más lento, pero que produce
más etanol y además aumenta el rendimiento (es decir, la cantidad de etanol
generado por la cantidad de glucosa consumida).</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Se decide probar también la
producción de etanol partiendo de otro de las clases de azúcares que os
mencioné al principio, una pentosa, en este caso, la xilosa haciéndose un
cultivo “batch”. Se observó que el consumo de este azúcar es más lento, pero se
obtiene una producción mayor de etanol que en el “batch” de glucosa, pese a
presentar una productividad menor (cantidad de producto por el volumen y el
tiempo que tarda en generarlo).</div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Así que, como podemos ver,
gracias a este método tan novedoso, aplicando una técnica tan de vanguardia
como la del ClosTron conseguimos aumentar la producción de un metabolito tan
interesante como el etanol, reduciendo la producción de otras sustancias que no
resultan menos interesantes, el butanol, en este caso, sola y exclusivamente
quitándonos un gen de por medio.</div>
<div class="MsoNoSpacing">
<span lang="EN-US"><br /></span></div>
<div class="MsoNoSpacing">
<span lang="EN-US"><b>Fuentes</b>: Switching <i>Clostridium
acetobutylicum</i> to an ethanol producer by disruption of the butyrate/butanol
fermentative pathway. Dörte Lehmann, Tina Lüke.Eversloh. <i>Metabolic engineering</i> (2011)<o:p></o:p></span></div>
<div class="MsoNormal">
<span lang="EN-US">The
ClosTron: A universal gene knock-out system for the genus <i>Clostridium</i>. J. T. Heap et al. <i>Journal
of Microbiological Methods</i> (2007)<o:p></o:p></span></div>
Mario Toubeshttp://www.blogger.com/profile/14027769200615990756noreply@blogger.com0tag:blogger.com,1999:blog-5493163009858964489.post-75143050036959768942012-09-13T03:12:00.002-07:002012-11-02T01:57:05.818-07:00Generación de un nuevo antibiótico por ingeniería metabólica<br />
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;">Actualmente uno de los mercados
más fuertes dentro de la biotecnología son los antibióticos, esas sustancias
que nos meten por los ojos y oídos por todos lados ante el imperativo de no
tomarlos a la ligera para evitar que los organismos a los que buscan eliminar
desarrollen resistencia frente a ellos. Ante la respuesta de adaptación a esta
clase de medicamentos, es necesaria la obtención de unos nuevos o de mejora de
los existentes, de tal forma que podamos seguir combatiendo las infecciones
bacterianas de forma eficiente. Una de las formas de conseguir mejorar la
productividad de esta clase de medicamente es mediante la INGENIERÍA
METABÓLICA.</span></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;"><br /></span></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;">Dentro de los antibióticos hay
gran variedad de grupos, pero los más conocidos son los β-lactámicos, total, ¿quién no
ha escuchado nunca hablar de la <b>penicilina</b>?
Dentro de esto grupo aparecen otra familia de antibióticos, conocidos como las <b>cefalosporinas</b> que son superiores a las
penicilinas. ¿Por qué? Porque presentan un <u>mayor espectro</u> (son capaces de
atacar a mayor variedad de patógenos), mayor potencia (son más efectivos frente
a ellos), <u>baja toxicidad</u> (no nos hacen demasiado daño a nosotros) y presentan
<u>resistencia a la β-lactamasa</u> (enzima que ataca a los antibióticos
penicilánicos y los degrada, y por tanto, hace a las bacterias resistentes
frente a ellos).</span></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;"><br /></span></div>
<table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="float: left; margin-right: 1em; text-align: left;"><tbody>
<tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgsCLMqp2f-oACd6Wo8Ha2f1rh4r3ylNr2WOpeoGnCgtlJMpkuFLfGjROTzzKLRhHbDj-Aanh0UAvys5LaalCkKo9JnfzDs1sP0612q4kv5Ywj1eqTXUAQRYxxiyGU9WF_66Wr9ilbrzYIk/s1600/acremonium.jpg" imageanchor="1" style="clear: left; margin-bottom: 1em; margin-left: auto; margin-right: auto;"><span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;"><img border="0" height="131" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEgsCLMqp2f-oACd6Wo8Ha2f1rh4r3ylNr2WOpeoGnCgtlJMpkuFLfGjROTzzKLRhHbDj-Aanh0UAvys5LaalCkKo9JnfzDs1sP0612q4kv5Ywj1eqTXUAQRYxxiyGU9WF_66Wr9ilbrzYIk/s200/acremonium.jpg" width="200" /></span></a></td></tr>
<tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><i><span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif; font-size: small;">Acremonium</span></i></td></tr>
</tbody></table>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;">Hasta aquí todo bien, salvo un
pequeño problema: el organismo productor de las cefalosporinas es <i>Acremonium chrysogenum </i>que presenta un rendimiento más bien bajo.
Para solucionar esto se modificó el genoma de otro microorganismo, muy conocido
dentro de la biotecnología, <i>Penicillium chrysogenum</i>
que es capaz de producir un metabolito, el primero de la ruta de biosíntesis de
la ruta de las cefalosporinas, llamado: 7-ADCA (ácido
adipoil-7-aminodesacetoxicefalosporánico y... SÍ, YO TAMBIÉN HE TENIDO QUE LEERLO
VARIOS VECES PARA QUE SUENE ALGO CON SENTIDO EN MI CABEZA, MALDIGAMOS A LOS
QUÍMICOS ORGÁNICOS POR TALES PALABROS, NO PODÍAN LLAMARLO EUFRASIO) </span></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;"><br /></span></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;">Veamos cómo lo hacen:</span></div>
<table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="float: right; text-align: right;"><tbody>
<tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhJDW8iSnn6IgXZP8dq-SGnzb6PVKIzvuDGWShKsz2btVlpuwuSxnmF4oyFf-0Dt85MbLOeiblWt0KznY9TsrMc7UjQdh_2EmfD3a_3rxV04ZpbTtxpfO4kizlVDsa77qgsLQEI7HbYTt0O/s1600/penicillium.jpg" imageanchor="1" style="clear: right; margin-bottom: 1em; margin-left: auto; margin-right: auto;"><span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;"><img border="0" height="200" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhJDW8iSnn6IgXZP8dq-SGnzb6PVKIzvuDGWShKsz2btVlpuwuSxnmF4oyFf-0Dt85MbLOeiblWt0KznY9TsrMc7UjQdh_2EmfD3a_3rxV04ZpbTtxpfO4kizlVDsa77qgsLQEI7HbYTt0O/s200/penicillium.jpg" width="198" /></span></a></td></tr>
<tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><i><span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif; font-size: small;">Penicillium</span></i></td></tr>
</tbody></table>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;">Primero obtienen el gen <b>cefEF</b> de <i>A. chrysogenum</i>. Pero la pregunta es…. ¿cómo se puede hacer eso?
Pues vamos a verlo, ¿no? Existe una técnica dentro de la biología molecular,
cuyas iniciales son <b>PCR</b> (reacción en
cadena de la polimerasa) que consiste en la obtención de un fragmento de ADN
que aparece flanqueado por dos secuencias de ADN que nosotros conocemos. Lo que
hacemos es introducir dos fragmentos complementarios a esas secuencias
flanqueantes, conocidos como primers, en la reacción y que restringe el
fragmento que vamos a amplificar, a través de una serie de reacciones
encadenadas y cíclicas amplificamos este ADN y lo recuperamos (aquí teneís un vídeo explicatorio de la PCR y... ¡¡CON ACENTO ARGENTINO!! <a href="http://www.youtube.com/watch?v=Kuy4PDb6bdU">http://www.youtube.com/watch?v=Kuy4PDb6bdU</a>). En los primers nosotros podemos introducir ciertas
modificaciones, como por ejemplo, regiones de corte de enzimas de restricción,
que son las tijeras de los biólogos moleculares. Estas enzimas cortan esta
secuencia y luego gracias a las ligasasas, que serían el pegamento, podemos
llevarnos nuestro fragmento de interés a un plásmido, que sería el almacén. Los
plásmidos son ADN circular y en nuestro caso presenta una zona que determinará
que se sintetice nuestra proteína (el promotor) y otra zona que determinará el
final de la trascripción (el terminador).</span></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;"><br /></span></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;">Pues bien, esta técnica se aplica
en dos genes diferentes, uno es conocido como cefEF y que corresponde (la
palabra correcta es ‘codifica’) a una proteína llamada <b>expandasa/hidroxilasa</b>, que se encarga de reestructura el
metabolito, de tal forma que pase de la familia de la penicilina a la familia
de la cefalosporina, y además la modifica, añadiéndole un grupo –OH, la
hidroxila. </span></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;"><br /></span></div>
<table cellpadding="0" cellspacing="0" class="tr-caption-container" style="float: left; margin-right: 1em; text-align: left;"><tbody>
<tr><td style="text-align: center;"><a href="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEggPxQGrxC7yNLQYcbdKjxZu1sH-x4e9y_h1x62HboOqOrCDjkZ6c32KqyOsUZR1KI-cNBtF8WZt2NhjzTVxNVmHy1bFMfy3NbBoGuzGoIdejFY1feYzBf5YmQYcPbQjVBKn8nynCjIapW7/s1600/streptomyces.png" imageanchor="1" style="clear: left; margin-bottom: 1em; margin-left: auto; margin-right: auto;"><span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;"><img border="0" src="https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEggPxQGrxC7yNLQYcbdKjxZu1sH-x4e9y_h1x62HboOqOrCDjkZ6c32KqyOsUZR1KI-cNBtF8WZt2NhjzTVxNVmHy1bFMfy3NbBoGuzGoIdejFY1feYzBf5YmQYcPbQjVBKn8nynCjIapW7/s1600/streptomyces.png" /></span></a></td></tr>
<tr><td class="tr-caption" style="text-align: center;"><i><span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif; font-size: small;">Streptomyces</span></i></td></tr>
</tbody></table>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;">Por otro lado, se obtiene otro
gen, este <i>Streptomyces clavuligerus</i>, y que responde al nombre <b>cmcH</b>,
codificando a una enzima conocida como <b>3’-hidroximetilcefen-O-carbamoiltransferasa</b>,
que se encarga de modificar de nuevo el metabolito (carbamoilación), sobre la modificación que
produjo la anterior enzima, produciendo así el metabolito final que queríamos
obtener adACCA (venga, os prometo que ya es el último palabro: ácido
adipoil-7-amino-3-carbamoiloximetil-3-cefem-4-carboxílico).</span></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;"><br /></span></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;">Estos dos genes se introducen
plásmido y una vez lo tenemos se lo metemos (transformamos, o mejor dicho, al
meter dos plásmidos co-transformamos) a <i>P.
chrysogenum</i>, lo que nos dará una cepa productora de el antibiótico, que
servirá como base para la síntesis química de gran cantidad de antibióticos.</span></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;"><br /></span></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;">Así es como a partir de la
introducción de sólo dos genes, hemos conseguido generar un nuevo organismo
productor de antibióticos. ¿Es o no es útil la ingeniería metabólica?</span></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;"><br /></span></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;">Si quieres ver la ruta completa, haz click <a href="http://yfrog.com/ode86esj">aquí</a>.</span></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;"><br /></span></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<span lang="EN-US"><span style="font-family: Helvetica Neue, Arial, Helvetica, sans-serif;">Fuente: <b>Engineering of Penicillium chrysogenum
for fermentative production of a novel carbamoylated cephem antibiotic
precursor</b>. Diana M. Harris et al. Metabolic Engineering 11 (2009)</span><o:p></o:p></span></div>
Mario Toubeshttp://www.blogger.com/profile/14027769200615990756noreply@blogger.com3tag:blogger.com,1999:blog-5493163009858964489.post-36919942341381718492012-09-06T10:30:00.000-07:002012-10-24T04:22:47.553-07:00Presentación<br />
<div class="MsoNormal">
<w:sdt contentlocked="t" id="89512093" sdtgroup="t"><span style="font-family: "Calibri","sans-serif"; font-size: 1.0pt; mso-ansi-language: ES; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-bidi-font-family: "Times New Roman"; mso-bidi-language: AR-SA; mso-bidi-theme-font: minor-bidi; mso-fareast-font-family: "Times New Roman"; mso-fareast-language: ES; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-theme-font: minor-latin;"><w:sdtpr></w:sdtpr><w:sdt docpart="7A2EF7E6C29F4C62BF62394917850A5A" id="89512082" storeitemid="X_C76A0F39-BF51-4B36-A22C-3FA4C5D5450E" text="t" title="Título de la entrada de blog" xpath="/ns0:BlogPostInfo/ns0:PostTitle"></w:sdt></span>
</w:sdt></div>
<div class="Publishwithline">
<span style="text-align: justify;">Saludos,</span></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<o:p></o:p></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<br /></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
inauguro
este blog con la ilusión de dar a conocer algo que, en general es bastante
desconocido. Esto hablando de la <b>Ingeniería
Metabólica</b>. Y la pregunta es... ¿eso qué es? Pues bien, buscando la
definición del hombre que creó la Ingeniería Metabólica, el gran Gregory
Stephanopoulos: “técnicas de optimización genética y de los procesos
regulatorios en la célula para incrementar la producción de una cierta
sustancia”. Todo esto se hace gracias a técnicas de ingeniería genética que
serán cada una diferente en función del organismo en el que trabajemos y el
tipo de mejora que se busque. <o:p></o:p></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Sabiendo
esto podemos hablar de que la ingeniería metabólica es como un lego, consiste
en tomar las piezas (enzimas) que forman el puzzle que es el metabolismo del
organismo y jugar con ellas, de tal forma que hagamos que sean mejores, lo que
aceleraría la reacción que catalizan; empeorarlas lo que haría que se
ralentizase; hacer que desparezcan; o incluso llevárnosla de un organismo a
otro.<o:p></o:p></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
<b>¿Esto para qué sirve?</b> Vamos a resolver dudas por
partes:<o:p></o:p></div>
<div class="MsoNormal">
</div>
<ul>
<li style="text-align: justify;">Mejorar
una enzima: en el metabolismo aparecen unos puntos llamados 'cuello de botella'
en el que la velocidad de la ruta metabólica se ralentiza, y por más que
mejoremos el resto de enzimas la velocidad no aumenta. Serían una especie de
diques metabólicos. Mediante diferentes técnicas que desgranaremos en
subsiguientes post podemos hacer que la velocidad de esta reacción catalítica
aumente, mejorando la velocidad de la ruta.</li>
<li style="text-align: justify;">Empeorar
una enzima: en el metabolismo encontramos que una misma molécula o metabolito
puede seguir distintas rutas. En ocasiones nos interesa que nuestra molécula en
cuestión se dirija hacia una ruta, pero que mayoritariamente se dirige por
otra. Podemos pensar "¿y por qué no eliminamos la enzima que cataliza la
ruta que no nos interesa?" Pues bien, la respuesta es que en ocasiones, a
ruta que nos baja nuestro rendimiento es imprescindible para la célula y, si
desaparece, la célula no se puede desarrollar. Una solución de compromiso es
'dejar tocada' la enzima, de tal forma que siga funcionando, pero a un ritmo
más lento.</li>
<li style="text-align: justify;">Eliminación
(knock-out) de una enzima: pues si la ruta por la que va el metabolito no es
imprescindible podemos eliminar la primera enzima, lo que hará que toda la
molécula de interés vaya por la ruta que queremos.</li>
<li style="text-align: justify;">Traslado
de la ruta a otro organismo: consiste en tomar el gen o los genes implicados en
la ruta de interés de un organismo que la posea a otro que no o cuyo
rendimiento sea menor.</li>
</ul>
<o:p></o:p><br />
<div class="MsoNormal">
<o:p></o:p></div>
<div class="MsoNormal">
<o:p></o:p></div>
<div class="MsoNormal">
<o:p></o:p></div>
<div class="MsoNormal" style="text-align: justify;">
Esto
es sólo una introducción, para que veáis lo que se puede hacer gracias a las
técnicas de esta nueva ingeniería. Intentaré tener esto más o menos
actualizado, subiendo ejemplos de lo que se hace para que veáis la aplicación
que esto tiene y os pondré las referencias a los artículos que he usado para
elaborar el post. Me gustaría que este blog fuera interactivo entre vosotros y
yo, que me propusierais temas que os interesen, que me preguntéis dudas que
surjan, y sobre ello ampliar y exponerlo
por aquí, igual que sí veis que aparece algún error o algo que se queda
desactualizado que me lo hagáis saber. Para ello podéis contactar con la cuenta
de Twitter @<b>metablogismo</b><o:p></o:p></div>
<div class="MsoNormal">
<br /></div>
<br />Mario Toubeshttp://www.blogger.com/profile/14027769200615990756noreply@blogger.com3