Dra. S. cerevisae, oncóloga

Taxus brevifolia

El taxol, comercializado bajo el nombre comercial de Paclitaxel® es un terpenoide (biomoléculas derivado del isopreno obtenido por primera vez de una especie de tejo, llamado Taxus brevifolia. Es una biomolécula altamente funcionalizada lo que dificulta en gran medida su síntesis por métodos exclusivamente químicos, por lo que es necesario partir de intermediarios de su ruta biosintética u otros metabolitos similares conocidos como taxoides. El principal problema que presenta este compuesto activo es la baja concentración que se presenta en el extracto de la corteza del tejo, incrementando en gran medida los gastos de purificación, además de necesitar grandes cantidades de la corteza del árbol para obtenerlo. Además se ha visto que varios hongos endofíticos (se desarrollan junto al tejo) son también capaces de producir taxol, pero a concentraciones mucho más bajas.

El proceso biosintético del taxol es muy complejo e involucra la acción de 19 enzimas partiendo de un intermediario común como geranilgeranil difostato. Varios de los genes codificantes de estas enzimas ya han sido indentificados y purificados, pero otros no, por lo que no se puede reconstruir la ruta por completo. El punto clave en la ruta de este fármaco es llevado a cabo por la enzima taxodieno sintasa, encargada de provocar una triple ciclación originando el taxa-4(5),11(12)-dieno. A partir de este metabolito se producen varias oxigenaciones llevadas a cabo por enzimas de la familia de los citocromos P450, monooxigenasas, que producirán finalmente el tan deseado taxol.

Sulfolobus acidocaldarius

A la hora de aplicar ingeniería metabólica sobre la ya famosa Saccharomyces cerevisiae nos encontramos con bajas concentraciones de geranilgeranil difosfato (GGPP), lo que hará que no aparezca residuo alguna de taxadieno pese a introducirle las enzimas de la ruta biosintética. Para solucionar este problema es opta por transformar el microorganismo con geranilgeranil disfosfato sintasa de dos organismos diferentes, de Taxus chinensis (una planta) y de Sulfolobus acidocaldarius (una arquea acidófila y termófila). Para ello se clonaron estos dos genes en plásmidos pVV200. Por otro lado, se transformó también con el plásmido pVV214 con el gen de la taxadieno sintasa de T. chinensis, el problema es que al proceder de un organismo tan alejado evolutivamente hablando es que, pese a que el código genético (es decir, la relación entre los nucléotidos de DNA y los aminoácidos de la proteína a la que codifica) es el mismo, no todos los organismos tienen la misma concentración de aminoácidos en el citoplasma de sus células disponible para la síntesis de proteína, lo que dificulta la expresión de ciertos péptidos, si un aminoácido es particularme abundante en la proteína y escaso en la célula hospedadora. Así que para solucionarlo se hace un “apaño” es decir, se modifican ciertos codones para que sean más acordes con el uso de codones de la propia célula que va a expresar la proteína.  Toda esta parrafada anterior viene a que se hace también una versión más compatible de la taxadieno sintasa y se introduce también en el vector pVV214. Se observó que pese a que la taxadieno sintasa de T. chinensis carecía de la secuencia que la mandaba a los plastos la cantidad de GGPP que se producía era muy baja por sí misma, por lo que con el mismo promotor, llamado PGK y activado por glucosa, la geranilgeranil difosfato sintasa, ya se conseguía acumular una cantidad significativa de taxadieno.

Saccharomyces cerevisiae

Se hace también una versión truncada (a la que le falta un fragmento) de una proteína propia de S. cerevisiae llamada 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa y que se llamará tHMG-CoA reductasa y que será codificada por el gen tmhgr, que es clonada en el plásmido pVV200.

La levadura se transformó usando el método del acetato. No se observó que la expresión de los genes exógenos provocara ningún problema a la levadura.

Se sabe que en S. cerevisiae se acumula el farnesil difosfato, un precursos de nuestro taxadieno, pero que en la levadura se usa para la producción de esteroles (sustancias con diferentes funciones y que tiene miembros muy conocidos, como el colesterol), aunque también minoritariamente para la síntesis de otras clases de biomoléculas. En la ruta del farnesil difosfato aparece una proteína llamada 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa. Se hace también una versión truncada, es decir que le falta un fragmento correspondiente al extremo N-terminal y que es un dominio regulatorio, provocando la inhibición de la proteína en ciertas situaciones. Esta modificación hace que no se bloquee su actividad, aumentando la disponibilidad del metabolito necesario para la síntesis de la biomolécula de nuestro interés. Esta proteína se codifica por un gen llamado thmgr (3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa truncada). Con esta aproximación se observó un incremento de la producción del taxadieno de un 50% respecto a la producción con sólo las dos proteínas vegetales.

Pero no todo queda aquí, sino que se les ocurre una nueva mejora, con un redirección del flujo de carbono, disminuyendo el paso por la ruta de los esteroides. Se sabe que la levadura en condiciones aeróbicas no es capaz de asimilar los esteroides suplementados en el medio, hecho conocido como exclusión aeróbica de esteroles. Este efecto se produce porque en presencia de oxígeno los citocromos P450 con actividad monooxigenasa están inactivos, por lo que no se pueden sintetizar nuevos esteroles. Este proceso se regula por un gen llamado UPC2. Existe un variante de este gen, conocido como UPC2.1, cuya proteína permite la absorción de estas sustancias en condiciones aeróbicas. Se introduce este gen porque bastante le cuesta a la pobre célula la síntesis esteroles, necesarios para ella, como para encima darle caña en forma de taxadieno.

Identificando los niveles de proteína de la geranil geranil difosfatos sintasa se ve que son bajos, probablemente asociado a la diferencia en el uso de codones. Para solucionarlo se buscan análogos de esta proteína en otros organismo y se llega a uno en Sulfolobus acidocaldarius, pero que usa como sustrato dimetilalil difosfato, lo que permite aumenta la expresión de geranil geranil difosfato por dos lados diferentes sin que se hagan competencia por el sustrato las enzimas. La expresión de este gen, además del resto ya introducidos provocó una leve subida en la producción de taxol, pero un gran incremento de geranilgeraniol (CUIDADO, QUE ESTE ES DIFERENTE…). Analizando estos datos encontramos que el cuello de botella, es decir, la reacción limitante es el paso a taxadieno.

Pues mira, ya que nos hemos propuesto empetar a nuestra levadura, pues vamos a coger y a mejorar la última enzima, pero, ¿cómo? Fácil, pues cogemos la taxadieno sintasa y vemos que es rica en arginina, un aminoácido bastante raro, pues las sustituimos por otros aminoácidos y como resultado obtenemos un incremento en la producción de taxadieno de… ¡¡40 veces!!

Como podemos ver el trabajo tiene su recompensa y el haber trabajado tanto sobre esta levadura, hemos conseguido una producción importante de un precursor de una sustancia que puede salvar muchas vidas.

Fuente: Metabolic engineering of taxadiene biosynthesis in yeast as a first step towards Taxol (Paclitaxel) production. Benedikt Engels et al. Metabolic Engineering 10 (2008)

¡¡Syne!! Anda y súbeme una de butanol

Synechococcus elongatus

En un post anterior (éste) hablaba de la producción de un biocombustible como es el etanol, pues bien en este otro hablaremos de otro: el 1-butanol. Este compuesto se puede utilizar como base de partida para la obtención química de varios productos, pero más importante que eso es que tiene capacidad para almacenar energía y luego ser usada como combustible, ya que es muy similar a la gasolina. Para producirlo, metabólicamente hablando, hay dos formas: la ruta sintética de los 2-cetoácidos, o bien la dependiente de coenzima A (CoA). 

En este trabajo se usa una cianobacteria llamada Synechococcus elongatus y de las estrategias que he mencionado el grupo opta por la segunda ruta y, para ello, le introducen la friolera de… ¡¡5 GENES!! Estos genes son hbd, crt y adh2 del ya mencionado Clostridium acetobutylicum, el gen ter de Tremponema denticola y el gen atoB  de Escherichia coli.

Para introducir los genes a la cianobacteria se usan plásmidos que recombinan, es decir que se insertan, dentro del genoma del microorganismo. Además, para evitar que se produzcan disrupciones de genes y “daños colaterales” no deseados hay dos sitios caracterizados en los cuales se pueden llevar a cabo estos procesos inocuamente y que se conocen como “sitios neutral I” y “sitio neutral II”. Estos plásmidos, para construirse y luego ser transformados en nuestro microorganismo, se desarrollan en E. coli. Como 5 genes en un único plásmido es demasiado deciden distribuirlos en dos plásmidos diferentes, que se llamarán pEL5, que se dirigirá hacia el NSI y contendrá los genes atoB y adhE2 , y pEL14 que se dirigirá hacia el NSII y que llevará los tres restantes genes. Cada uno de los plásmidos conferirá asimismo una resistencia diferente, siendo el primero a espectinomicina y el segundo a kanamicina. Además el ter de T. denticola se modifica, añadiendo lo que se conoce como cola de polihistidinas. Esta modificación tiene como función el ser reconocida por un anticuerpo, lo que luego nos permitirá identificarla al unírselo. Para expresar estos genes se sitúan bajo promotores inducibles (es decir, la expresión se da bajo ciertas condiciones) en este caso inducibles por lactosa.

Ruta metabólica introducida

Para transformar a S. elongatus  se deja que el cultivo se esté desarrollando en fase exponencial (es decir, cuando más crece) y entonces se le añade el DNA exógeno que queremos que incorpore, dejándolo todo la noche a oscuras para que se dé a cabo la asimilación. Posteriormente, para seleccionar aquellos individuos que lo han introducido satisfactoriamente se añaden dos antibióticos que actúan como marcadores y que son la espectinomicina y la kanamicina, como ya mencionamos antes, y se siembra en placa. Cuando aparecen las colonias se “pican”, es decir, se toma parte y se analiza por PCR para ver si se ha producido la inserción de los fragmentos de interés. Una vez demostrada esta inserción se toma una de las colonias para continuar con los experimentos.

Colonias de S. elongatus en placa de Petri

El siguiente paso consiste en el cultivo en medio líquido en botellas con tapón de rosca de 250ml. Las condiciones para el cultivo son con, para que sea un cultivo aeróbico, o sin un burbujeo constante de una mezcla gaseosa de 5% CO₂/95% N₂. Cómo podemos ver, son condiciones anaeróbicas, es decir, no hay oxígeno. Para inducir la expresión de los genes se usa un reactivo conocido como IPTG, una sustancia análoga a la lactosa y que es capaz de activar la expresión de los genes situados bajo promotores inducible por el mencionado azúcar y que además presenta la ventaja de que no puede ser metabolizado como fuente de carbono, lo que hace que quede en el medio de cultivo activando la expresión.

Estudiaron la producción del 1-butanol en diferentes condiciones

• Con presencia de oxígeno y luz constante y no se observó nada de producción del mencionado biocombusible.
• Con burbujeo constante de 5 CO₂%/95% N₂ buscando la purgación de todo el oxígeno y con iluminación, produciéndose unas cantidades ínfimas de 1-butanol.
•  El siguiente paso consistió en incubar en oscuridad, además de con el que burbujeo, con esto se consigue eliminar completamente el oxígeno, ya que al no producirse la fotosíntesis no se acumula. El resultado fue que se llegaron a producir cantidades significativas de butanol.

Estos resultados hacen creer que el oxígeno es un inhibidor de la producción del alcohol. Para comprobrar esta tesis, se utilizó un reactivo llamado 3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetilurea (reconocedlo, ya echabáis de menos los nombres complicados. Bueno, pues aquí os van las siglas, desde siempre haciendo las cosas más fáciles: DCMU) que es un inhibidor del fotosistema II (PSII), bloqueando la capacidad de la cianobacteria de producir el O₂.  Este compuesto se añadió a cultivos que se sometieron a condiciones óxicas y anóxicas y con diferentes concentraciones del DCMU. La condición de oscuridad es dejó como control, sin que se añadiese el inhibidor, total, no hace falta, en oscuridad no se produce oxígeno. El resultado fue que a mayores concentraciones de DCMU en condiciones anóxicas se acumulaba mayor concentración de 1-butanol. La conclusión de esto es clara: no es la luz la que bloquea la producción del alcohol, sino la presencia de oxígeno.

Concluyendo, como podemos ver no sólo en las bacterias está el futuro de la energía, sino que las microalgas tienen mucho que decir en este campo, siendo capaces de nutrirse del CO₂ del aire, que tan contaminante se llega a considerar y darnos como resultado productos que no resultan tan interesantes como el 1-butanol. Además gracias a este artículo se va que la producción del alcohol butílico está influido para la presencia de oxígeno, por lo que el paso a nivel industrial requerirá de adaptación a dicha condición.

Fuente: Metabolic engineering of cyanobacteria for 1-butanol production form carbon dioxide. Ethan I. Lan et al. Metabolic engineering 13 (2011)

¡Hya!¡Fusión! o de cómo fusionar dos hongos (y sus respectivos metabolismos)

Uno de los mayores problemas a los que se enfrentan los ingenieros ambientales, los ingenieros químicos, los microbiólogos y demás profesionales que trabajan con residuos y contaminación, es la presencia de ciertas sustancias conocidas como recalcitrantes, es decir, difíciles de degradar. Una de estas sustancias xilano es el que aparece como parte de los residuos procedentes de los vegetales, como las maderas, y que forman parte de los conocidos como residuos lignocelulósicos. Para resolver el problema de su difícil procesado hasta ahora se hacían tratamientos químicos, caros y altamente contaminantes, pero ha aparecido una solución: el tratamiento enzimático.

Schizosaccharomyces pombe

Hay dos tipos de enzimas que atacan a los xilanos, la endo-β-xilanasas y las β-D-xilosidasas. El xilano pertenece a la familia de los polímeros, es decir, moléculas formadas por la repetición de moléculas más sencillas, conocidas como monómeros. La misión de estas enzimas consiste en dejar al descubierto los azúcares (sus monómeros) que forman el xilano para que puedan ser utilizados para ser fermentados, lo cual se conoce como sacarificación). Por tanto, nos encontramos ante un proceso, que está actualmente muy de moda conocido como sacarificación y fermentación simultánea. Además las levaduras son preferidas sobre las bacterias para trabajar en la industria por sus resistentes paredes celulares y su gran tamaño, lo que las hace más resistentes a emborr… digo al etanol.

Lentinula edodes

En este caso se decide aplicar una estrategia muy arriesgada: la fusión de protoplastos (células que no poseen pared celular). Esta técnica consiste en juntar dos células de organismos diferentes y fusionarlas, literalmente, para generar un nuevo organismo que tendrá características de ambos, como los metabolismos, que se entrelazan pudiendo degradar diferentes sustratos o generar nuevos productos. Los organismos que se deciden fusionar son por un lado la levadura Schizosaccharomyces pombey la seta (qué poco científico soy a veces) Lentinula edodes.

Esto es un pellet

Para la fusión de protoplastos se cultivaron por un lado la S. pombe durante 48 horas a 30ºC y se trataron con un extracto de un hongo productor de enzimas que rompen la pared celular. Las setas de L. edodes, por otro lado se diseccionaron hasta dejar fragmenos pequeños y se incubaron a 30ºC para que se acostumbrara a la temperatura de desarrollo de la levadura. El paso siguiente es sembrar en placa de Petri y de ahí tomar muestras, centrifugarlas por separado, para que se nos queden las células en forma de pellet  en el fondo del eppendorf. De ahí añadimos de nuevo el extracto de enzima degradadora de pared que hablamos y tratamos ambas muestras. Así es cómo se generan los protoplastos.

Comparación entre la levadura,
el hongo y el fusante

Llega el momento de hacerlos fusionar. Para ello se hace una mezcla 1:1 de los dos tipos celulares, es decir, el mismo número de células de cada especie. Se mezclan y se centrifugan de forma que quede un pellet. Se le añade una solución que contiene PEG (sé qué en vuestra cabeza está sonando lo siguiente “PEG, PEG… ¿de qué me suena?”. Pues coged, dejad el ordenador, id al baño y mirad la etiqueta del gel, o del champú… o de cualquier producto de higiene) o polietilenglicol, una sustancia que fluidiza las membranas. Tras esto se centrifuga y se siembra en un hueco que se hace en una placa con agar especial, conocido como agar de regeneración. Se añade otra capa de este agar formando una especie de sándwich de protoplastos (reconoced que queréis probarlo vosotros también). Se dejan que crezcan a 30ºC durante 2-3 días y después con un microscopio se seleccionan y se vuelven a sembrar. Se repite este ciclo diez veces, para asegurarnos que tenemos células estables, que llamaremos fusantes. Se observa que la morfología de estas células nuevas no corresponde con las anteriores, ya que parecen levaduras elongadas, pero que se unen formando pseudomicelios, como haría una hongo.

Ya tenemos nuestro nuevo organismo, y ahora lo que queremos es analizar dos cosas: por un lado la capacidad que tiene de asimilar diferentes fuentes de carbono y, por otro lado, que capacidad tiene para la síntesis de polioles. Se usaron 28 fuentes de carbono distintas en este estudio y se observó que la levadura inicial podía usar 8 de ellas, mientras que el fusante podía usar las 28. Además con 15 de ellas podía generar gases, mientras que la levadura sólo podía usar 5. Se centraron particularmente en tres fuentes de carbono: glucosa, xilano y xilosa.

·         En el caso de la glucosa se alcanzó una concentración de biomasa (la masa que presentan las células) de 20.12 g/L. Además, sorprendentemente… se produjo etanol, hasta una concentración de unos 80 g/L. También, ya que el bicho estaba por sorprender, a partir del sexto día comenzó a producir arabitol, hasta unos límites de 8.56 g/L.

·         La xilosa, por otro lado, al ser usada como fuente de carbono permitió alcanzar un nivel de biomasa de 18.23 g/L, ligeramente menor que el conseguido con glucosa. Como consecuencia del metabolismo de esta sustancia se produce xilitol, un poliol usado como edulcorante, pero tras pasar un tiempo se comienza a consumir. Por otro lado, también se produce arabitol, alcanzando valores que rondan unos 19 g/L.

Pero el punto más fuerte de este experimento es el uso de xilano, una sustancia recalcitrante como ya dije y, por tanto, difícilmente degradable. Nuestro fusante es capaz de romper estos enlaces (hidrolización) para obtener la xilosa y usarla como fuente de carbono para alimentarse. Usando esta fuente de carbono alcanza unos valores similares a los que se mencionó antes, es decir, unos 18.10-18.40 g/L. Se produce arabitol hasta alcanzar una cota de 63.78 g/L (vamos, lo que viene a ser un pasote) y de xilitol superando los 60 g/L también, pero, como todo en esta vida, no todo va a ser un campo de rosas, y obtenemos una producción nula de etanol.

Complementariamente a este último experimento se indagó si sería el fusante capaz de utilizar como fuente de carbono residuos agrícolas, como restos de maíz o de arroz, obteniendo un rendimiento similar al anteriormente mencionado

Concluyendo… este bicho, este híbrido interespecífico ha venido al mundo a revolucionarlo. Come de todo lo que le echen y encima, nos produce sustancias de interés, polioles. Oye, ¿qué queréis que os diga? Yo me lo quedo.

Fuente: Construction of an intergeneric fusion from Schizosaccharomyces pombe and Lentinula edodes for xylan degradation and polyol production. Cheng-Chang Lin et al. Enzyme and microbial technology (2005)

Superproducción de L-fenilalanina en B. subtilis

Quizás hayamos escuchado alguna vez el concepto “aminoácido esencial” sin saber realmente qué es eso. Pues bien, esta clase de sustancias son los aminoácidos que el propio organismo no puede sintetizar por no poseer las rutas biosintéticas que llevan hasta la producción de dicho metabolito, pero que le son necesarios. Como podemos suponer de dicho enunciado, la esencialidad o no esencialidad depende del propio organismo y no es un hecho general para toda la variedad de la vida. La única vía que tenemos para tener estas sustancias es a través de la dieta. Uno de estos aminoácidos es la L-fenilalanina, un aminoácido aromático que actúa de precursor para otro, la tirosina. ¿Cómo hacemos para obtenerlo en grandes cantidades?

La estrategia que se ha utilizado para este experimento es diferente al resto, ya que buscamos, en este caso, la sobreexpresión de una proteína en concreto. Aquí será la corismato mutasa, (en la ruta metabólica está recuadrada en verde en esta imagen) codificada por el gen aroH, presente en el propio genoma de Bacillus subtilis, entonces la pregunta es: ¿para qué hacer esto?

B. subtillis

Pues la respuesta es sencilla, la bacteria en cuestión produce bajas concentraciones de fenilalanina (Phe), así que un incremento de la actividad de una de las enzimas que lleva a la producción de este aminoácido provocará un desequilibrio de la ruta metabólica, conllevando una acumulación de la sustancia de interés. El método para hacerlo consiste en clonar el gen aroH en un plásmido multicopia (aparece en número alto de copias del mismo) lo que hará que incremente la concentración de dicha proteína.

Para hacer esto, primero es necesario obtener el ADN de B. subtilis. Para ello, se rompe la célula (se hace una lisis) partiendo de un cultivo en el que las células están en buena salud, creciendo exponencialmente. Para obtener el gen aroH se utiliza la ya mencionada PCR usando primers específicos que contienen secuencias reconocidas por las enzimas de restricción SalI y BamHI. Una vez amplificado este gen se introduce en un plásmido, llamado pUC19, gracias a las dos enzimas de restricción anteriormente mencionadas, para poder mantenerlo en E. coli que se manifestará por el desarrollo de la resistencia al antibiótico ampicilina. El método de transformación es la coprecipitación con CaCl_2, esta sustancia se une al ADN cargado negativamente y lo acerca al núcleo del lipopolisacárido (estos son parte de la pared celular bacteriana, que actúa como protección), lo que permite que cuando le demos un golpe de calor a la bacteria pase al interior celular y se lleve a cabo la transformación. Para poder después transformarlo en B. subtilis, usando las mismas enzimas de restricción, que usamos en nuestra bacteria de interés recurrimos a un sistema conocido como “shuttle vector” o vector lanzadera, llamado pMK4, el cual nos permitirá el cultivo en los dos microorganismos, además podremos seleccionar resistentes a dos antibióticos, la ampicilina y el cloranfenicol. Para transformar al bacilo se usa la electroporación que ya mencioné en el post anterior. La ventaja que presenta tenerlo en un plásmido multicopia, como es el caso, es que va a aparecer un mayor número del gen, lo que hará que también sea mayor la concentración de la proteína. 

E. coli

Se sabe que la fenilalanina inhibe en gran medida su propia producción, ya que inhibe a una enzima que responde al nombre de 3-desoxi-D-arabinoheptulosa-7-fostafo sintasa, que es la primera enzima que desvía desde la rama principal hacia la síntesis de aminoácidos aromáticos. Si quieres ver la ruta, pincha aquí. Para evitar esta inhibición, se alimentó a las células con dos metabolitos intermedios de la ruta y que están justo antes de esta enzima, de tal forma que el equilibrio químico queda desplazado, evitando que se produzca la inhibición. Estas sustancias son eritrosa-4-fostato y fosfoenolpiruvato (no es quejaréis, ¿eh? Que estas son facilitas). De hecho se observa que al alimentar con estos dos reactivos aumenta la concentración varias veces.

Ahora bien, en E. coli y en B. subtilis este aumento de la producción de fenilalanina es diferente. En el primero microorganismo se da una duplicación de la producción, menor que en el bacilo porque presenta 3 diferentes DHAP sintasas, cada una sujeta a inhibición por un aminoácido diferente, siendo casi 3 veces superior la producción de éste.

Con estos resultados, hemos visto que es posible aumentar la producción de uno de los aminoácidos, pero ya teniendo este nodo controlado… ¿quién sabe si en un futuro no muy lejano podamos maximizar la producción de los otros dos aminoácidos aromáticos, la tirosina y el triptófano?

P.d. si abrís la imagen veréis que es una maraña, además, lo más divertido es que en el artículo la llaman la “ruta simplificada”, qué cachondos…

Metabolic engineering of aromatic group amino acid pathway in Bacillus subtilis for L-phenylalanine production I.S. Özçelik et al.  Chemical Engineering Science (2004)

¿Cómo hacer una bacteria borracha o apañar la ruta metabólica de un clostridio para producir etanol?

Nos encontramos actualmente en una época en la que se produce una gran demanda de producción de etanol, y pese al título de la entrada, no para emborrachar bacterias o personas. La necesidad industrial del etanol en la sociedad actual va para industria, en muy diferentes campos; uno de los más importantes es la producción de bioetanol, teniendo en cuenta los problemas con el agotamiento del petróleo del mundo contemporáneo y su incremento de precio.

Saccharomyces cerevisiae

Se sabe que el microorganismo más eficiente en la producción en la producción de este alcohol es la levadura Saccharomyces cerevisae, seguida por las bacterias del género Clostridium. Pese a este segundo puesto el uso de estos microorganismos presenta ventajas sobre el uso de levaduras. La principal es la capacidad que tienen de usar como sustrato, es decir, como alimento para su desarrollo y la producción de etanol, azúcares que presentan en su estructura anillos de 5 ó 6 carbonos (pentosas y hexosas), a diferencia de la levadura, que sólo usa hexosas.

Los clostridios se caracteriza por tener un metabolismo fermentativo conocido como bifásico, debido a que se produce en dos tiempos. La primera fase, de crecimiento, se caracteriza porque el microorganismo toma azúcares del medio y los metaboliza hasta convertirlo en ácidos como el butírico o el acético, por lo que se conoce como acidogéneis; mientras que en la segunda fase, estacionaria, es decir, no se produce un aumento de la población bacteriana, se producen solventes orgánicos, como la acetona, el etanol y el butanol; esta parte del metabolismo se conoce como solventogénesis. Estas tres sustancias son las que dan nombre a la fermentación que producen este generación: la fermentación ABE. Si quieres ver un esquema de la ruta, pulsa aquí.

Un concepto importante a tener en cuenta para este post es el flujo de carbono, es decir, el camino, la ruta por la que va pasando este elemento. El carbono es igual para todos los metabolitos, pero la célula tiene mecanismos para dirigirlo hacia unos productos u otros, en función de sus necesidades. Pues bien, ya sabiendo esto, en el artículo que os voy a ir desgranando en este post los investigadores buscan redirigir el flujo de carbono hacia el etanol, en lugar de que se dirija hacia la acetona o los ácidos. Para ello, se pueden bloquear distintas enzimas para que se dejen de producir metabolitos indeseados, pero la enzima que se decide atacar es la Hbd o 3-hidroxibutiril-Coenzima A deshidrogenasa que aparece justo después del desvío de un metabolito intermedio hacia la producción de acetona. Esto hace que sólo nos queden dos de los tres solventes que mencionamos a la hora de definir la fermentación ABE, el etanol y la acetona… ¡EA!  (tenía que decirlo).

Hasta aquí todo muy bien, pero la pregunta es: ¿cómo se elimina una enzima? O como diría un biotecnólogo: “¿Cómo se genera un knock-out?”

Hasta ahora para generar un knock-out lo que se hacía era eliminar el gen por doble recombinación, que será contada en otro post, pero este método se ha visto que es poco eficiente para las bacterias del género Clostridium. Para ello se diseñó un sistema conocido como ClosTron. En esta aproximación lo que se hace es introducir en la secuencia especial, el intrón. Esta clase de regiones de DNA no se traducen a proteína, además, aplicando el sistema del ClosTron no se introduce exactamente por recombinación entre el DNA del plásmido en el que va clonado y el cromosoma bacteriano, sino que se da por la aparición de un RNA intermedio. Esto hace que la eficiencia de la introducción de la mutación aumente. Pues muy bien, gracias a la introducción de este fragmento de 69/70 pares de bases (bp), podemos bloquear la expresión del gen de interés, la Hbd. Este fragmento se clona en un plásmido y se transforma la bacteria con él utilizando un método conocido como electroporación, que consiste en pegarle un calambrazo a la bacteria, de tal forma que, momentáneamente, se abren poros en la membrana bacteriana y el ADN que queremos introducir pasa a la célula. Claro, después de este “shock” se le dan mimitos, un medio que le guste para crecer y así se recupera y ya podemos seleccionar las bacterias que hayan introducido nuestro plásmido. Para hacer esto hay un sistemas “muy apañao” que consiste en que los plásmidos, además del gen de interés, presentan una gen que les confiere una resistencia a un antibiótico, así que lo único que se debe hacer es cultivar el microorganismo en una placa que contenga esta sustancia, así, los que no posean el plásmido mueren por acción del antibiótico y las colonias que sobreviven son portadores de nuestro plásmido.

Clostridium acetobutylicum

Una vez hecho esto, analizamos la actividad productora de etanol de nuestro Clostridium acetobutylicum, se cultivan en modo “batch”, esto es de forma discontinua, teniendo a nuestra bacteria en un medio líquido sin alimentación hasta que nosotros queramos o hasta que agote los nutrientes. Si analizamos los productos, vemos que no aparecen metabolitos 4C (con cuatro carbonos, que serían el butanol y el butirato, por lo cual podemos concluir que SÍ que se ha producido una disrupción de la ruta metabólica antes de que se produzcan dichas sustancias. Pero no todo va a ser tan bonito, se observa a la vez que el mutante crece a un ritmo más lento que el nativo.

Se sabe que la cantidad de glucosa en el medio es el factor limitante para la producción de etanol, por lo que deciden hacer una mejora en el sistema anterior de cultivo, alimentándolo con glucosa y evitar así el agotamiento de este sustrato. Con este método se observa que el crecimiento del microorganismo es más lento, pero que produce más etanol y además aumenta el rendimiento (es decir, la cantidad de etanol generado por la cantidad de glucosa consumida).

Se decide probar también la producción de etanol partiendo de otro de las clases de azúcares que os mencioné al principio, una pentosa, en este caso, la xilosa haciéndose un cultivo “batch”. Se observó que el consumo de este azúcar es más lento, pero se obtiene una producción mayor de etanol que en el “batch” de glucosa, pese a presentar una productividad menor (cantidad de producto por el volumen y el tiempo que tarda en generarlo).

Así que, como podemos ver, gracias a este método tan novedoso, aplicando una técnica tan de vanguardia como la del ClosTron conseguimos aumentar la producción de un metabolito tan interesante como el etanol, reduciendo la producción de otras sustancias que no resultan menos interesantes, el butanol, en este caso, sola y exclusivamente quitándonos un gen de por medio.

Fuentes: Switching Clostridium acetobutylicum to an ethanol producer by disruption of the butyrate/butanol fermentative pathway. Dörte Lehmann, Tina Lüke.Eversloh. Metabolic engineering (2011)

The ClosTron: A universal gene knock-out system for the genus Clostridium. J. T. Heap et al. Journal of Microbiological Methods (2007)

Generación de un nuevo antibiótico por ingeniería metabólica

Actualmente uno de los mercados más fuertes dentro de la biotecnología son los antibióticos, esas sustancias que nos meten por los ojos y oídos por todos lados ante el imperativo de no tomarlos a la ligera para evitar que los organismos a los que buscan eliminar desarrollen resistencia frente a ellos. Ante la respuesta de adaptación a esta clase de medicamentos, es necesaria la obtención de unos nuevos o de mejora de los existentes, de tal forma que podamos seguir combatiendo las infecciones bacterianas de forma eficiente. Una de las formas de conseguir mejorar la productividad de esta clase de medicamente es mediante la INGENIERÍA METABÓLICA.

Dentro de los antibióticos hay gran variedad de grupos, pero los más conocidos son los β-lactámicos, total, ¿quién no ha escuchado nunca hablar de la penicilina? Dentro de esto grupo aparecen otra familia de antibióticos, conocidos como las cefalosporinas que son superiores a las penicilinas. ¿Por qué? Porque presentan un mayor espectro (son capaces de atacar a mayor variedad de patógenos), mayor potencia (son más efectivos frente a ellos), baja toxicidad (no nos hacen demasiado daño a nosotros) y presentan resistencia a la β-lactamasa (enzima que ataca a los antibióticos penicilánicos y los degrada, y por tanto, hace a las bacterias resistentes frente a ellos).

Acremonium

Hasta aquí todo bien, salvo un pequeño problema: el organismo productor de las cefalosporinas es Acremonium chrysogenum  que presenta un rendimiento más bien bajo. Para solucionar esto se modificó el genoma de otro microorganismo, muy conocido dentro de la biotecnología, Penicillium chrysogenum que es capaz de producir un metabolito, el primero de la ruta de biosíntesis de la ruta de las cefalosporinas, llamado: 7-ADCA (ácido adipoil-7-aminodesacetoxicefalosporánico y... SÍ, YO TAMBIÉN HE TENIDO QUE LEERLO VARIOS VECES PARA QUE SUENE ALGO CON SENTIDO EN MI CABEZA, MALDIGAMOS A LOS QUÍMICOS ORGÁNICOS POR TALES PALABROS, NO PODÍAN LLAMARLO EUFRASIO)

Veamos cómo lo hacen:

Penicillium

Primero obtienen el gen cefEF de A. chrysogenum. Pero la pregunta es…. ¿cómo se puede hacer eso? Pues vamos a verlo, ¿no? Existe una técnica dentro de la biología molecular, cuyas iniciales son PCR (reacción en cadena de la polimerasa) que consiste en la obtención de un fragmento de ADN que aparece flanqueado por dos secuencias de ADN que nosotros conocemos. Lo que hacemos es introducir dos fragmentos complementarios a esas secuencias flanqueantes, conocidos como primers, en la reacción y que restringe el fragmento que vamos a amplificar, a través de una serie de reacciones encadenadas y cíclicas amplificamos este ADN y lo recuperamos (aquí teneís un vídeo explicatorio de la PCR y... ¡¡CON ACENTO ARGENTINO!! http://www.youtube.com/watch?v=Kuy4PDb6bdU). En los primers nosotros podemos introducir ciertas modificaciones, como por ejemplo, regiones de corte de enzimas de restricción, que son las tijeras de los biólogos moleculares. Estas enzimas cortan esta secuencia y luego gracias a las ligasasas, que serían el pegamento, podemos llevarnos nuestro fragmento de interés a un plásmido, que sería el almacén. Los plásmidos son ADN circular y en nuestro caso presenta una zona que determinará que se sintetice nuestra proteína (el promotor) y otra zona que determinará el final de la trascripción (el terminador).

Pues bien, esta técnica se aplica en dos genes diferentes, uno es conocido como cefEF y que corresponde (la palabra correcta es ‘codifica’) a una proteína llamada expandasa/hidroxilasa, que se encarga de reestructura el metabolito, de tal forma que pase de la familia de la penicilina a la familia de la cefalosporina, y además la modifica, añadiéndole un grupo –OH, la hidroxila.

Streptomyces

Por otro lado, se obtiene otro gen, este Streptomyces clavuligerus, y que responde al nombre cmcH, codificando a una enzima conocida como 3’-hidroximetilcefen-O-carbamoiltransferasa, que se encarga de modificar de nuevo el metabolito (carbamoilación), sobre la modificación que produjo la anterior enzima, produciendo así el metabolito final que queríamos obtener adACCA (venga, os prometo que ya es el último palabro: ácido adipoil-7-amino-3-carbamoiloximetil-3-cefem-4-carboxílico).

Estos dos genes se introducen plásmido y una vez lo tenemos se lo metemos (transformamos, o mejor dicho, al meter dos plásmidos co-transformamos) a P. chrysogenum, lo que nos dará una cepa productora de el antibiótico, que servirá como base para la síntesis química de gran cantidad de antibióticos.

Así es como a partir de la introducción de sólo dos genes, hemos conseguido generar un nuevo organismo productor de antibióticos. ¿Es o no es útil la ingeniería metabólica?

Si quieres ver la ruta completa, haz click aquí.

Fuente: Engineering of Penicillium chrysogenum for fermentative production of a novel carbamoylated cephem antibiotic precursor. Diana M. Harris et al. Metabolic Engineering 11 (2009)

Presentación

Saludos,

inauguro este blog con la ilusión de dar a conocer algo que, en general es bastante desconocido. Esto hablando de la Ingeniería Metabólica. Y la pregunta es... ¿eso qué es? Pues bien, buscando la definición del hombre que creó la Ingeniería Metabólica, el gran Gregory Stephanopoulos: “técnicas de optimización genética y de los procesos regulatorios en la célula para incrementar la producción de una cierta sustancia”. Todo esto se hace gracias a técnicas de ingeniería genética que serán cada una diferente en función del organismo en el que trabajemos y el tipo de mejora que se busque.

Sabiendo esto podemos hablar de que la ingeniería metabólica es como un lego, consiste en tomar las piezas (enzimas) que forman el puzzle que es el metabolismo del organismo y jugar con ellas, de tal forma que hagamos que sean mejores, lo que aceleraría la reacción que catalizan; empeorarlas lo que haría que se ralentizase; hacer que desparezcan; o incluso llevárnosla de un organismo a otro.

¿Esto para qué sirve? Vamos a resolver dudas por partes:

• Mejorar una enzima: en el metabolismo aparecen unos puntos llamados 'cuello de botella' en el que la velocidad de la ruta metabólica se ralentiza, y por más que mejoremos el resto de enzimas la velocidad no aumenta. Serían una especie de diques metabólicos. Mediante diferentes técnicas que desgranaremos en subsiguientes post podemos hacer que la velocidad de esta reacción catalítica aumente, mejorando la velocidad de la ruta.
• Empeorar una enzima: en el metabolismo encontramos que una misma molécula o metabolito puede seguir distintas rutas. En ocasiones nos interesa que nuestra molécula en cuestión se dirija hacia una ruta, pero que mayoritariamente se dirige por otra. Podemos pensar "¿y por qué no eliminamos la enzima que cataliza la ruta que no nos interesa?" Pues bien, la respuesta es que en ocasiones, a ruta que nos baja nuestro rendimiento es imprescindible para la célula y, si desaparece, la célula no se puede desarrollar. Una solución de compromiso es 'dejar tocada' la enzima, de tal forma que siga funcionando, pero a un ritmo más lento.
• Eliminación (knock-out) de una enzima: pues si la ruta por la que va el metabolito no es imprescindible podemos eliminar la primera enzima, lo que hará que toda la molécula de interés vaya por la ruta que queremos.
• Traslado de la ruta a otro organismo: consiste en tomar el gen o los genes implicados en la ruta de interés de un organismo que la posea a otro que no o cuyo rendimiento sea menor.

Esto es sólo una introducción, para que veáis lo que se puede hacer gracias a las técnicas de esta nueva ingeniería. Intentaré tener esto más o menos actualizado, subiendo ejemplos de lo que se hace para que veáis la aplicación que esto tiene y os pondré las referencias a los artículos que he usado para elaborar el post. Me gustaría que este blog fuera interactivo entre vosotros y yo, que me propusierais temas que os interesen, que me preguntéis dudas que surjan,  y sobre ello ampliar y exponerlo por aquí, igual que sí veis que aparece algún error o algo que se queda desactualizado que me lo hagáis saber. Para ello podéis contactar con la cuenta de Twitter @metablogismo