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| Taxus brevifolia |
El taxol, comercializado bajo el nombre comercial de Paclitaxel® es un
terpenoide (biomoléculas derivado del isopreno obtenido por primera vez de una
especie de tejo, llamado Taxus brevifolia. Es una biomolécula altamente funcionalizada lo que
dificulta en gran medida su síntesis por métodos exclusivamente químicos, por
lo que es necesario partir de intermediarios de su ruta biosintética u otros
metabolitos similares conocidos como taxoides.
El principal problema que presenta este compuesto activo es la baja
concentración que se presenta en el extracto de la corteza del tejo,
incrementando en gran medida los gastos de purificación, además de necesitar
grandes cantidades de la corteza del árbol para obtenerlo. Además se ha visto
que varios hongos endofíticos (se desarrollan junto al tejo) son también
capaces de producir taxol, pero a concentraciones mucho más bajas.
El proceso biosintético del taxol
es muy complejo e involucra la acción de 19 enzimas partiendo de un
intermediario común como geranilgeranil difostato. Varios de los genes
codificantes de estas enzimas ya han sido indentificados y purificados, pero otros
no, por lo que no se puede reconstruir la ruta por completo. El punto clave en
la ruta de este fármaco es llevado a cabo por la enzima taxodieno sintasa,
encargada de provocar una triple ciclación originando el
taxa-4(5),11(12)-dieno. A partir de este metabolito se producen varias
oxigenaciones llevadas a cabo por enzimas de la familia de los citocromos P450,
monooxigenasas, que producirán finalmente el tan deseado taxol.
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| Sulfolobus acidocaldarius |
A la hora de aplicar ingeniería
metabólica sobre la ya famosa Saccharomyces
cerevisiae nos encontramos con bajas concentraciones de geranilgeranil
difosfato (GGPP), lo que hará que no aparezca residuo alguna de taxadieno pese
a introducirle las enzimas de la ruta biosintética. Para solucionar este
problema es opta por transformar el microorganismo con geranilgeranil disfosfato sintasa
de dos organismos diferentes, de Taxus
chinensis (una planta) y de Sulfolobus
acidocaldarius (una arquea acidófila y termófila). Para ello se clonaron
estos dos genes en plásmidos pVV200. Por otro lado, se transformó también con
el plásmido pVV214 con el gen de la taxadieno
sintasa de T. chinensis, el
problema es que al proceder de un organismo tan alejado evolutivamente hablando
es que, pese a que el código genético (es decir, la relación entre los
nucléotidos de DNA y los aminoácidos de la proteína a la que codifica) es el
mismo, no todos los organismos tienen la misma concentración de aminoácidos en
el citoplasma de sus células disponible para la síntesis de proteína, lo que
dificulta la expresión de ciertos péptidos, si un aminoácido es particularme abundante en la proteína y escaso en la célula hospedadora. Así que para solucionarlo se hace
un “apaño” es decir, se modifican ciertos codones para que sean más acordes con
el uso de codones de la propia célula que va a expresar la proteína. Toda esta parrafada anterior viene a que se
hace también una versión más compatible de la taxadieno sintasa y se introduce
también en el vector pVV214. Se observó que pese a que la taxadieno sintasa de T. chinensis carecía de la secuencia que
la mandaba a los plastos la cantidad de GGPP que se producía era muy baja por
sí misma, por lo que con el mismo promotor, llamado PGK y activado por glucosa,
la geranilgeranil difosfato sintasa, ya se conseguía acumular una cantidad
significativa de taxadieno.
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| Saccharomyces cerevisiae |
Se hace también una versión
truncada (a la que le falta un fragmento) de una proteína propia de S. cerevisiae llamada 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa y
que se llamará tHMG-CoA reductasa y que será codificada por el gen tmhgr, que
es clonada en el plásmido pVV200.
La levadura se transformó usando
el método del acetato. No se observó que la expresión de los genes exógenos
provocara ningún problema a la levadura.
Se sabe que en S. cerevisiae se acumula el farnesil
difosfato, un precursos de nuestro taxadieno, pero que en la levadura se usa
para la producción de esteroles (sustancias con diferentes funciones y que
tiene miembros muy conocidos, como el colesterol), aunque también
minoritariamente para la síntesis de otras clases de biomoléculas. En la ruta
del farnesil difosfato aparece una proteína llamada 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa. Se hace también una
versión truncada, es decir que le falta un fragmento correspondiente al extremo
N-terminal y que es un dominio regulatorio, provocando la inhibición de la
proteína en ciertas situaciones. Esta modificación hace que no se bloquee su actividad, aumentando la disponibilidad
del metabolito necesario para la síntesis de la biomolécula de nuestro interés.
Esta proteína se codifica por un gen llamado thmgr (3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA
reductasa truncada). Con esta aproximación se observó un incremento de la
producción del taxadieno de un 50% respecto a la producción con sólo las dos
proteínas vegetales.
Pero no todo queda aquí, sino que
se les ocurre una nueva mejora, con un redirección del flujo de carbono,
disminuyendo el paso por la ruta de los esteroides. Se sabe que la levadura en
condiciones aeróbicas no es capaz de asimilar los esteroides suplementados en
el medio, hecho conocido como exclusión
aeróbica de esteroles. Este efecto se produce porque en presencia de
oxígeno los citocromos P450 con actividad monooxigenasa están inactivos, por lo que no se pueden sintetizar nuevos esteroles. Este
proceso se regula por un gen llamado UPC2. Existe un variante de este gen,
conocido como UPC2.1, cuya proteína
permite la absorción de estas sustancias en condiciones aeróbicas. Se introduce
este gen porque bastante le cuesta a la pobre célula la síntesis esteroles,
necesarios para ella, como para encima darle caña en forma de taxadieno.
Identificando los niveles de
proteína de la geranil geranil difosfatos sintasa se ve que son bajos,
probablemente asociado a la diferencia en el uso de codones. Para solucionarlo
se buscan análogos de esta proteína en otros organismo y se llega a uno en Sulfolobus acidocaldarius, pero que usa
como sustrato dimetilalil difosfato, lo que permite aumenta la expresión de
geranil geranil difosfato por dos lados diferentes sin que se hagan competencia
por el sustrato las enzimas. La expresión de este gen, además del resto ya
introducidos provocó una leve subida en la producción de taxol, pero un gran
incremento de geranilgeraniol (CUIDADO, QUE ESTE ES DIFERENTE…). Analizando estos datos encontramos que el cuello de botella, es decir,
la reacción limitante es el paso a taxadieno.
Pues mira, ya que nos hemos
propuesto empetar a nuestra levadura, pues vamos a coger y a mejorar la última
enzima, pero, ¿cómo? Fácil, pues cogemos la taxadieno sintasa y vemos que es
rica en arginina, un aminoácido bastante raro, pues las sustituimos por otros
aminoácidos y como resultado obtenemos un incremento en la producción de
taxadieno de… ¡¡40 veces!!
Como podemos ver el trabajo tiene
su recompensa y el haber trabajado tanto sobre esta levadura, hemos conseguido
una producción importante de un precursor de una sustancia que puede salvar
muchas vidas.
Fuente: Metabolic engineering of taxadiene
biosynthesis in yeast as a first step towards Taxol (Paclitaxel) production.
Benedikt Engels et al. Metabolic
Engineering 10 (2008)
