Dra. S. cerevisae, oncóloga

Taxus brevifolia

El taxol, comercializado bajo el nombre comercial de Paclitaxel® es un terpenoide (biomoléculas derivado del isopreno obtenido por primera vez de una especie de tejo, llamado Taxus brevifolia. Es una biomolécula altamente funcionalizada lo que dificulta en gran medida su síntesis por métodos exclusivamente químicos, por lo que es necesario partir de intermediarios de su ruta biosintética u otros metabolitos similares conocidos como taxoides. El principal problema que presenta este compuesto activo es la baja concentración que se presenta en el extracto de la corteza del tejo, incrementando en gran medida los gastos de purificación, además de necesitar grandes cantidades de la corteza del árbol para obtenerlo. Además se ha visto que varios hongos endofíticos (se desarrollan junto al tejo) son también capaces de producir taxol, pero a concentraciones mucho más bajas.

El proceso biosintético del taxol es muy complejo e involucra la acción de 19 enzimas partiendo de un intermediario común como geranilgeranil difostato. Varios de los genes codificantes de estas enzimas ya han sido indentificados y purificados, pero otros no, por lo que no se puede reconstruir la ruta por completo. El punto clave en la ruta de este fármaco es llevado a cabo por la enzima taxodieno sintasa, encargada de provocar una triple ciclación originando el taxa-4(5),11(12)-dieno. A partir de este metabolito se producen varias oxigenaciones llevadas a cabo por enzimas de la familia de los citocromos P450, monooxigenasas, que producirán finalmente el tan deseado taxol.

Sulfolobus acidocaldarius

A la hora de aplicar ingeniería metabólica sobre la ya famosa Saccharomyces cerevisiae nos encontramos con bajas concentraciones de geranilgeranil difosfato (GGPP), lo que hará que no aparezca residuo alguna de taxadieno pese a introducirle las enzimas de la ruta biosintética. Para solucionar este problema es opta por transformar el microorganismo con geranilgeranil disfosfato sintasa de dos organismos diferentes, de Taxus chinensis (una planta) y de Sulfolobus acidocaldarius (una arquea acidófila y termófila). Para ello se clonaron estos dos genes en plásmidos pVV200. Por otro lado, se transformó también con el plásmido pVV214 con el gen de la taxadieno sintasa de T. chinensis, el problema es que al proceder de un organismo tan alejado evolutivamente hablando es que, pese a que el código genético (es decir, la relación entre los nucléotidos de DNA y los aminoácidos de la proteína a la que codifica) es el mismo, no todos los organismos tienen la misma concentración de aminoácidos en el citoplasma de sus células disponible para la síntesis de proteína, lo que dificulta la expresión de ciertos péptidos, si un aminoácido es particularme abundante en la proteína y escaso en la célula hospedadora. Así que para solucionarlo se hace un “apaño” es decir, se modifican ciertos codones para que sean más acordes con el uso de codones de la propia célula que va a expresar la proteína.  Toda esta parrafada anterior viene a que se hace también una versión más compatible de la taxadieno sintasa y se introduce también en el vector pVV214. Se observó que pese a que la taxadieno sintasa de T. chinensis carecía de la secuencia que la mandaba a los plastos la cantidad de GGPP que se producía era muy baja por sí misma, por lo que con el mismo promotor, llamado PGK y activado por glucosa, la geranilgeranil difosfato sintasa, ya se conseguía acumular una cantidad significativa de taxadieno.

Saccharomyces cerevisiae

Se hace también una versión truncada (a la que le falta un fragmento) de una proteína propia de S. cerevisiae llamada 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa y que se llamará tHMG-CoA reductasa y que será codificada por el gen tmhgr, que es clonada en el plásmido pVV200.

La levadura se transformó usando el método del acetato. No se observó que la expresión de los genes exógenos provocara ningún problema a la levadura.

Se sabe que en S. cerevisiae se acumula el farnesil difosfato, un precursos de nuestro taxadieno, pero que en la levadura se usa para la producción de esteroles (sustancias con diferentes funciones y que tiene miembros muy conocidos, como el colesterol), aunque también minoritariamente para la síntesis de otras clases de biomoléculas. En la ruta del farnesil difosfato aparece una proteína llamada 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa. Se hace también una versión truncada, es decir que le falta un fragmento correspondiente al extremo N-terminal y que es un dominio regulatorio, provocando la inhibición de la proteína en ciertas situaciones. Esta modificación hace que no se bloquee su actividad, aumentando la disponibilidad del metabolito necesario para la síntesis de la biomolécula de nuestro interés. Esta proteína se codifica por un gen llamado thmgr (3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa truncada). Con esta aproximación se observó un incremento de la producción del taxadieno de un 50% respecto a la producción con sólo las dos proteínas vegetales.

Pero no todo queda aquí, sino que se les ocurre una nueva mejora, con un redirección del flujo de carbono, disminuyendo el paso por la ruta de los esteroides. Se sabe que la levadura en condiciones aeróbicas no es capaz de asimilar los esteroides suplementados en el medio, hecho conocido como exclusión aeróbica de esteroles. Este efecto se produce porque en presencia de oxígeno los citocromos P450 con actividad monooxigenasa están inactivos, por lo que no se pueden sintetizar nuevos esteroles. Este proceso se regula por un gen llamado UPC2. Existe un variante de este gen, conocido como UPC2.1, cuya proteína permite la absorción de estas sustancias en condiciones aeróbicas. Se introduce este gen porque bastante le cuesta a la pobre célula la síntesis esteroles, necesarios para ella, como para encima darle caña en forma de taxadieno.

Identificando los niveles de proteína de la geranil geranil difosfatos sintasa se ve que son bajos, probablemente asociado a la diferencia en el uso de codones. Para solucionarlo se buscan análogos de esta proteína en otros organismo y se llega a uno en Sulfolobus acidocaldarius, pero que usa como sustrato dimetilalil difosfato, lo que permite aumenta la expresión de geranil geranil difosfato por dos lados diferentes sin que se hagan competencia por el sustrato las enzimas. La expresión de este gen, además del resto ya introducidos provocó una leve subida en la producción de taxol, pero un gran incremento de geranilgeraniol (CUIDADO, QUE ESTE ES DIFERENTE…). Analizando estos datos encontramos que el cuello de botella, es decir, la reacción limitante es el paso a taxadieno.

Pues mira, ya que nos hemos propuesto empetar a nuestra levadura, pues vamos a coger y a mejorar la última enzima, pero, ¿cómo? Fácil, pues cogemos la taxadieno sintasa y vemos que es rica en arginina, un aminoácido bastante raro, pues las sustituimos por otros aminoácidos y como resultado obtenemos un incremento en la producción de taxadieno de… ¡¡40 veces!!

Como podemos ver el trabajo tiene su recompensa y el haber trabajado tanto sobre esta levadura, hemos conseguido una producción importante de un precursor de una sustancia que puede salvar muchas vidas.

Fuente: Metabolic engineering of taxadiene biosynthesis in yeast as a first step towards Taxol (Paclitaxel) production. Benedikt Engels et al. Metabolic Engineering 10 (2008)