¡¡Syne!! Anda y súbeme una de butanol

Synechococcus elongatus

En un post anterior (éste) hablaba de la producción de un biocombustible como es el etanol, pues bien en este otro hablaremos de otro: el 1-butanol. Este compuesto se puede utilizar como base de partida para la obtención química de varios productos, pero más importante que eso es que tiene capacidad para almacenar energía y luego ser usada como combustible, ya que es muy similar a la gasolina. Para producirlo, metabólicamente hablando, hay dos formas: la ruta sintética de los 2-cetoácidos, o bien la dependiente de coenzima A (CoA). 

En este trabajo se usa una cianobacteria llamada Synechococcus elongatus y de las estrategias que he mencionado el grupo opta por la segunda ruta y, para ello, le introducen la friolera de… ¡¡5 GENES!! Estos genes son hbd, crt y adh2 del ya mencionado Clostridium acetobutylicum, el gen ter de Tremponema denticola y el gen atoB  de Escherichia coli.

Para introducir los genes a la cianobacteria se usan plásmidos que recombinan, es decir que se insertan, dentro del genoma del microorganismo. Además, para evitar que se produzcan disrupciones de genes y “daños colaterales” no deseados hay dos sitios caracterizados en los cuales se pueden llevar a cabo estos procesos inocuamente y que se conocen como “sitios neutral I” y “sitio neutral II”. Estos plásmidos, para construirse y luego ser transformados en nuestro microorganismo, se desarrollan en E. coli. Como 5 genes en un único plásmido es demasiado deciden distribuirlos en dos plásmidos diferentes, que se llamarán pEL5, que se dirigirá hacia el NSI y contendrá los genes atoB y adhE2 , y pEL14 que se dirigirá hacia el NSII y que llevará los tres restantes genes. Cada uno de los plásmidos conferirá asimismo una resistencia diferente, siendo el primero a espectinomicina y el segundo a kanamicina. Además el ter de T. denticola se modifica, añadiendo lo que se conoce como cola de polihistidinas. Esta modificación tiene como función el ser reconocida por un anticuerpo, lo que luego nos permitirá identificarla al unírselo. Para expresar estos genes se sitúan bajo promotores inducibles (es decir, la expresión se da bajo ciertas condiciones) en este caso inducibles por lactosa.

Ruta metabólica introducida

Para transformar a S. elongatus  se deja que el cultivo se esté desarrollando en fase exponencial (es decir, cuando más crece) y entonces se le añade el DNA exógeno que queremos que incorpore, dejándolo todo la noche a oscuras para que se dé a cabo la asimilación. Posteriormente, para seleccionar aquellos individuos que lo han introducido satisfactoriamente se añaden dos antibióticos que actúan como marcadores y que son la espectinomicina y la kanamicina, como ya mencionamos antes, y se siembra en placa. Cuando aparecen las colonias se “pican”, es decir, se toma parte y se analiza por PCR para ver si se ha producido la inserción de los fragmentos de interés. Una vez demostrada esta inserción se toma una de las colonias para continuar con los experimentos.

Colonias de S. elongatus en placa de Petri

El siguiente paso consiste en el cultivo en medio líquido en botellas con tapón de rosca de 250ml. Las condiciones para el cultivo son con, para que sea un cultivo aeróbico, o sin un burbujeo constante de una mezcla gaseosa de 5% CO₂/95% N₂. Cómo podemos ver, son condiciones anaeróbicas, es decir, no hay oxígeno. Para inducir la expresión de los genes se usa un reactivo conocido como IPTG, una sustancia análoga a la lactosa y que es capaz de activar la expresión de los genes situados bajo promotores inducible por el mencionado azúcar y que además presenta la ventaja de que no puede ser metabolizado como fuente de carbono, lo que hace que quede en el medio de cultivo activando la expresión.

Estudiaron la producción del 1-butanol en diferentes condiciones

• Con presencia de oxígeno y luz constante y no se observó nada de producción del mencionado biocombusible.
• Con burbujeo constante de 5 CO₂%/95% N₂ buscando la purgación de todo el oxígeno y con iluminación, produciéndose unas cantidades ínfimas de 1-butanol.
•  El siguiente paso consistió en incubar en oscuridad, además de con el que burbujeo, con esto se consigue eliminar completamente el oxígeno, ya que al no producirse la fotosíntesis no se acumula. El resultado fue que se llegaron a producir cantidades significativas de butanol.

Estos resultados hacen creer que el oxígeno es un inhibidor de la producción del alcohol. Para comprobrar esta tesis, se utilizó un reactivo llamado 3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetilurea (reconocedlo, ya echabáis de menos los nombres complicados. Bueno, pues aquí os van las siglas, desde siempre haciendo las cosas más fáciles: DCMU) que es un inhibidor del fotosistema II (PSII), bloqueando la capacidad de la cianobacteria de producir el O₂.  Este compuesto se añadió a cultivos que se sometieron a condiciones óxicas y anóxicas y con diferentes concentraciones del DCMU. La condición de oscuridad es dejó como control, sin que se añadiese el inhibidor, total, no hace falta, en oscuridad no se produce oxígeno. El resultado fue que a mayores concentraciones de DCMU en condiciones anóxicas se acumulaba mayor concentración de 1-butanol. La conclusión de esto es clara: no es la luz la que bloquea la producción del alcohol, sino la presencia de oxígeno.

Concluyendo, como podemos ver no sólo en las bacterias está el futuro de la energía, sino que las microalgas tienen mucho que decir en este campo, siendo capaces de nutrirse del CO₂ del aire, que tan contaminante se llega a considerar y darnos como resultado productos que no resultan tan interesantes como el 1-butanol. Además gracias a este artículo se va que la producción del alcohol butílico está influido para la presencia de oxígeno, por lo que el paso a nivel industrial requerirá de adaptación a dicha condición.

Fuente: Metabolic engineering of cyanobacteria for 1-butanol production form carbon dioxide. Ethan I. Lan et al. Metabolic engineering 13 (2011)