martes, 2 de octubre de 2012

Superproducción de L-fenilalanina en B. subtilis


Quizás hayamos escuchado alguna vez el concepto “aminoácido esencial” sin saber realmente qué es eso. Pues bien, esta clase de sustancias son los aminoácidos que el propio organismo no puede sintetizar por no poseer las rutas biosintéticas que llevan hasta la producción de dicho metabolito, pero que le son necesarios. Como podemos suponer de dicho enunciado, la esencialidad o no esencialidad depende del propio organismo y no es un hecho general para toda la variedad de la vida. La única vía que tenemos para tener estas sustancias es a través de la dieta. Uno de estos aminoácidos es la L-fenilalanina, un aminoácido aromático que actúa de precursor para otro, la tirosina. ¿Cómo hacemos para obtenerlo en grandes cantidades?

La estrategia que se ha utilizado para este experimento es diferente al resto, ya que buscamos, en este caso, la sobreexpresión de una proteína en concreto. Aquí será la corismato mutasa, (en la ruta metabólica está recuadrada en verde en esta imagen) codificada por el gen aroH, presente en el propio genoma de Bacillus subtilis, entonces la pregunta es: ¿para qué hacer esto?

B. subtillis
Pues la respuesta es sencilla, la bacteria en cuestión produce bajas concentraciones de fenilalanina (Phe), así que un incremento de la actividad de una de las enzimas que lleva a la producción de este aminoácido provocará un desequilibrio de la ruta metabólica, conllevando una acumulación de la sustancia de interés. El método para hacerlo consiste en clonar el gen aroH en un plásmido multicopia (aparece en número alto de copias del mismo) lo que hará que incremente la concentración de dicha proteína.


Para hacer esto, primero es necesario obtener el ADN de B. subtilis. Para ello, se rompe la célula (se hace una lisis) partiendo de un cultivo en el que las células están en buena salud, creciendo exponencialmente. Para obtener el gen aroH se utiliza la ya mencionada PCR usando primers específicos que contienen secuencias reconocidas por las enzimas de restricción SalI y BamHI. Una vez amplificado este gen se introduce en un plásmido, llamado pUC19, gracias a las dos enzimas de restricción anteriormente mencionadas, para poder mantenerlo en E. coli que se manifestará por el desarrollo de la resistencia al antibiótico ampicilina. El método de transformación es la coprecipitación con CaCl2, esta sustancia se une al ADN cargado negativamente y lo acerca al núcleo del lipopolisacárido (estos son parte de la pared celular bacteriana, que actúa como protección), lo que permite que cuando le demos un golpe de calor a la bacteria pase al interior celular y se lleve a cabo la transformación. Para poder después transformarlo en B. subtilis, usando las mismas enzimas de restricción, que usamos en nuestra bacteria de interés recurrimos a un sistema conocido como “shuttle vector” o vector lanzadera, llamado pMK4, el cual nos permitirá el cultivo en los dos microorganismos, además podremos seleccionar resistentes a dos antibióticos, la ampicilina y el cloranfenicol. Para transformar al bacilo se usa la electroporación que ya mencioné en el post anterior. La ventaja que presenta tenerlo en un plásmido multicopia, como es el caso, es que va a aparecer un mayor número del gen, lo que hará que también sea mayor la concentración de la proteína. 

E. coli
Se sabe que la fenilalanina inhibe en gran medida su propia producción, ya que inhibe a una enzima que responde al nombre de 3-desoxi-D-arabinoheptulosa-7-fostafo sintasa, que es la primera enzima que desvía desde la rama principal hacia la síntesis de aminoácidos aromáticos. Si quieres ver la ruta, pincha aquí. Para evitar esta inhibición, se alimentó a las células con dos metabolitos intermedios de la ruta y que están justo antes de esta enzima, de tal forma que el equilibrio químico queda desplazado, evitando que se produzca la inhibición. Estas sustancias son eritrosa-4-fostato y fosfoenolpiruvato (no es quejaréis, ¿eh? Que estas son facilitas). De hecho se observa que al alimentar con estos dos reactivos aumenta la concentración varias veces.

Ahora bien, en E. coli y en B. subtilis este aumento de la producción de fenilalanina es diferente. En el primero microorganismo se da una duplicación de la producción, menor que en el bacilo porque presenta 3 diferentes DHAP sintasas, cada una sujeta a inhibición por un aminoácido diferente, siendo casi 3 veces superior la producción de éste.

Con estos resultados, hemos visto que es posible aumentar la producción de uno de los aminoácidos, pero ya teniendo este nodo controlado… ¿quién sabe si en un futuro no muy lejano podamos maximizar la producción de los otros dos aminoácidos aromáticos, la tirosina y el triptófano?

P.d. si abrís la imagen veréis que es una maraña, además, lo más divertido es que en el artículo la llaman la “ruta simplificada”, qué cachondos…


Metabolic engineering of aromatic group amino acid pathway in Bacillus subtilis for L-phenylalanine production I.S. Özçelik et al.  Chemical Engineering Science (2004)

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