miércoles, 26 de septiembre de 2012

¿Cómo hacer una bacteria borracha o apañar la ruta metabólica de un clostridio para producir etanol?


Nos encontramos actualmente en una época en la que se produce una gran demanda de producción de etanol, y pese al título de la entrada, no para emborrachar bacterias o personas. La necesidad industrial del etanol en la sociedad actual va para industria, en muy diferentes campos; uno de los más importantes es la producción de bioetanol, teniendo en cuenta los problemas con el agotamiento del petróleo del mundo contemporáneo y su incremento de precio.

Saccharomyces cerevisiae
Se sabe que el microorganismo más eficiente en la producción en la producción de este alcohol es la levadura Saccharomyces cerevisae, seguida por las bacterias del género Clostridium. Pese a este segundo puesto el uso de estos microorganismos presenta ventajas sobre el uso de levaduras. La principal es la capacidad que tienen de usar como sustrato, es decir, como alimento para su desarrollo y la producción de etanol, azúcares que presentan en su estructura anillos de 5 ó 6 carbonos (pentosas y hexosas), a diferencia de la levadura, que sólo usa hexosas.
Los clostridios se caracteriza por tener un metabolismo fermentativo conocido como bifásico, debido a que se produce en dos tiempos. La primera fase, de crecimiento, se caracteriza porque el microorganismo toma azúcares del medio y los metaboliza hasta convertirlo en ácidos como el butírico o el acético, por lo que se conoce como acidogéneis; mientras que en la segunda fase, estacionaria, es decir, no se produce un aumento de la población bacteriana, se producen solventes orgánicos, como la acetona, el etanol y el butanol; esta parte del metabolismo se conoce como solventogénesis. Estas tres sustancias son las que dan nombre a la fermentación que producen este generación: la fermentación ABE. Si quieres ver un esquema de la ruta, pulsa aquí.

Un concepto importante a tener en cuenta para este post es el flujo de carbono, es decir, el camino, la ruta por la que va pasando este elemento. El carbono es igual para todos los metabolitos, pero la célula tiene mecanismos para dirigirlo hacia unos productos u otros, en función de sus necesidades. Pues bien, ya sabiendo esto, en el artículo que os voy a ir desgranando en este post los investigadores buscan redirigir el flujo de carbono hacia el etanol, en lugar de que se dirija hacia la acetona o los ácidos. Para ello, se pueden bloquear distintas enzimas para que se dejen de producir metabolitos indeseados, pero la enzima que se decide atacar es la Hbd o 3-hidroxibutiril-Coenzima A deshidrogenasa que aparece justo después del desvío de un metabolito intermedio hacia la producción de acetona. Esto hace que sólo nos queden dos de los tres solventes que mencionamos a la hora de definir la fermentación ABE, el etanol y la acetona… ¡EA!  (tenía que decirlo).

Hasta aquí todo muy bien, pero la pregunta es: ¿cómo se elimina una enzima? O como diría un biotecnólogo: “¿Cómo se genera un knock-out?”
Hasta ahora para generar un knock-out lo que se hacía era eliminar el gen por doble recombinación, que será contada en otro post, pero este método se ha visto que es poco eficiente para las bacterias del género Clostridium. Para ello se diseñó un sistema conocido como ClosTron. En esta aproximación lo que se hace es introducir en la secuencia especial, el intrón. Esta clase de regiones de DNA no se traducen a proteína, además, aplicando el sistema del ClosTron no se introduce exactamente por recombinación entre el DNA del plásmido en el que va clonado y el cromosoma bacteriano, sino que se da por la aparición de un RNA intermedio. Esto hace que la eficiencia de la introducción de la mutación aumente. Pues muy bien, gracias a la introducción de este fragmento de 69/70 pares de bases (bp), podemos bloquear la expresión del gen de interés, la Hbd. Este fragmento se clona en un plásmido y se transforma la bacteria con él utilizando un método conocido como electroporación, que consiste en pegarle un calambrazo a la bacteria, de tal forma que, momentáneamente, se abren poros en la membrana bacteriana y el ADN que queremos introducir pasa a la célula. Claro, después de este “shock” se le dan mimitos, un medio que le guste para crecer y así se recupera y ya podemos seleccionar las bacterias que hayan introducido nuestro plásmido. Para hacer esto hay un sistemas “muy apañao” que consiste en que los plásmidos, además del gen de interés, presentan una gen que les confiere una resistencia a un antibiótico, así que lo único que se debe hacer es cultivar el microorganismo en una placa que contenga esta sustancia, así, los que no posean el plásmido mueren por acción del antibiótico y las colonias que sobreviven son portadores de nuestro plásmido.

Clostridium acetobutylicum
Una vez hecho esto, analizamos la actividad productora de etanol de nuestro Clostridium acetobutylicum, se cultivan en modo “batch”, esto es de forma discontinua, teniendo a nuestra bacteria en un medio líquido sin alimentación hasta que nosotros queramos o hasta que agote los nutrientes. Si analizamos los productos, vemos que no aparecen metabolitos 4C (con cuatro carbonos, que serían el butanol y el butirato, por lo cual podemos concluir que SÍ que se ha producido una disrupción de la ruta metabólica antes de que se produzcan dichas sustancias. Pero no todo va a ser tan bonito, se observa a la vez que el mutante crece a un ritmo más lento que el nativo.

Se sabe que la cantidad de glucosa en el medio es el factor limitante para la producción de etanol, por lo que deciden hacer una mejora en el sistema anterior de cultivo, alimentándolo con glucosa y evitar así el agotamiento de este sustrato. Con este método se observa que el crecimiento del microorganismo es más lento, pero que produce más etanol y además aumenta el rendimiento (es decir, la cantidad de etanol generado por la cantidad de glucosa consumida).
Se decide probar también la producción de etanol partiendo de otro de las clases de azúcares que os mencioné al principio, una pentosa, en este caso, la xilosa haciéndose un cultivo “batch”. Se observó que el consumo de este azúcar es más lento, pero se obtiene una producción mayor de etanol que en el “batch” de glucosa, pese a presentar una productividad menor (cantidad de producto por el volumen y el tiempo que tarda en generarlo).

Así que, como podemos ver, gracias a este método tan novedoso, aplicando una técnica tan de vanguardia como la del ClosTron conseguimos aumentar la producción de un metabolito tan interesante como el etanol, reduciendo la producción de otras sustancias que no resultan menos interesantes, el butanol, en este caso, sola y exclusivamente quitándonos un gen de por medio.

Fuentes: Switching Clostridium acetobutylicum to an ethanol producer by disruption of the butyrate/butanol fermentative pathway. Dörte Lehmann, Tina Lüke.Eversloh. Metabolic engineering (2011)
The ClosTron: A universal gene knock-out system for the genus Clostridium. J. T. Heap et al. Journal of Microbiological Methods (2007)

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