Nos encontramos actualmente en
una época en la que se produce una gran demanda de producción de etanol, y pese
al título de la entrada, no para emborrachar bacterias o personas. La necesidad
industrial del etanol en la sociedad actual va para industria, en muy
diferentes campos; uno de los más importantes es la producción de bioetanol,
teniendo en cuenta los problemas con el agotamiento del petróleo del mundo
contemporáneo y su incremento de precio.
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| Saccharomyces cerevisiae |
Se sabe que el microorganismo más
eficiente en la producción en la producción de este alcohol es la levadura Saccharomyces cerevisae, seguida
por las bacterias del género Clostridium.
Pese a este segundo puesto el uso de estos microorganismos presenta ventajas
sobre el uso de levaduras. La principal es la capacidad que tienen de usar como
sustrato, es decir, como alimento para su desarrollo y la producción de etanol,
azúcares que presentan en su estructura anillos de 5 ó 6 carbonos (pentosas y
hexosas), a diferencia de la levadura, que sólo usa hexosas.
Los clostridios se caracteriza
por tener un metabolismo fermentativo conocido como bifásico, debido a que se produce en dos tiempos. La primera fase,
de crecimiento, se caracteriza porque el microorganismo toma azúcares del medio
y los metaboliza hasta convertirlo en ácidos como el butírico o el acético, por
lo que se conoce como acidogéneis; mientras que en la segunda fase,
estacionaria, es decir, no se produce un aumento de la población bacteriana, se
producen solventes orgánicos, como la acetona, el etanol y el butanol; esta
parte del metabolismo se conoce como solventogénesis. Estas tres sustancias son
las que dan nombre a la fermentación que producen este generación: la fermentación ABE. Si quieres ver un
esquema de la ruta, pulsa aquí.
Un concepto importante a tener en
cuenta para este post es el flujo de
carbono, es decir, el camino, la ruta por la que va pasando este elemento.
El carbono es igual para todos los metabolitos, pero la célula tiene mecanismos
para dirigirlo hacia unos productos u otros, en función de sus necesidades.
Pues bien, ya sabiendo esto, en el artículo que os voy a ir desgranando en este
post los investigadores buscan redirigir el flujo de carbono hacia el etanol,
en lugar de que se dirija hacia la acetona o los ácidos. Para ello, se pueden
bloquear distintas enzimas para que se dejen de producir metabolitos
indeseados, pero la enzima que se decide atacar es la Hbd o
3-hidroxibutiril-Coenzima A deshidrogenasa que aparece justo después del desvío
de un metabolito intermedio hacia la producción de acetona. Esto hace que sólo
nos queden dos de los tres solventes que mencionamos a la hora de definir la
fermentación ABE, el etanol y la acetona… ¡EA!
(tenía que decirlo).
Hasta aquí todo muy bien, pero la
pregunta es: ¿cómo se elimina una enzima? O como diría un biotecnólogo: “¿Cómo
se genera un knock-out?”
Hasta ahora para generar un
knock-out lo que se hacía era eliminar el gen por doble recombinación, que será
contada en otro post, pero este método se ha visto que es poco eficiente para
las bacterias del género Clostridium.
Para ello se diseñó un sistema conocido como ClosTron. En esta aproximación lo
que se hace es introducir en la secuencia especial, el intrón. Esta clase de
regiones de DNA no se traducen a proteína, además, aplicando el sistema del
ClosTron no se introduce exactamente por recombinación entre el DNA del
plásmido en el que va clonado y el cromosoma bacteriano, sino que se da por la
aparición de un RNA intermedio. Esto hace que la eficiencia de la introducción
de la mutación aumente. Pues muy bien, gracias a la introducción de este
fragmento de 69/70 pares de bases (bp), podemos bloquear la expresión del gen
de interés, la Hbd. Este fragmento se clona en un plásmido y se transforma la
bacteria con él utilizando un método conocido como electroporación, que consiste en pegarle un calambrazo a la
bacteria, de tal forma que, momentáneamente, se abren poros en la membrana
bacteriana y el ADN que queremos introducir pasa a la célula. Claro, después de
este “shock” se le dan mimitos, un medio que le guste para crecer y así se
recupera y ya podemos seleccionar las bacterias que hayan introducido nuestro
plásmido. Para hacer esto hay un sistemas “muy apañao” que consiste en que los
plásmidos, además del gen de interés, presentan una gen que les confiere una
resistencia a un antibiótico, así que lo único que se debe hacer es cultivar el
microorganismo en una placa que contenga esta sustancia, así, los que no posean
el plásmido mueren por acción del antibiótico y las colonias que sobreviven son
portadores de nuestro plásmido.
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| Clostridium acetobutylicum |
Una vez hecho esto, analizamos la
actividad productora de etanol de nuestro Clostridium
acetobutylicum, se cultivan en modo “batch”, esto es de forma discontinua,
teniendo a nuestra bacteria en un medio líquido sin alimentación hasta que
nosotros queramos o hasta que agote los nutrientes. Si analizamos los
productos, vemos que no aparecen metabolitos 4C (con cuatro carbonos, que
serían el butanol y el butirato, por lo cual podemos concluir que SÍ que se ha
producido una disrupción de la ruta metabólica antes de que se produzcan dichas
sustancias. Pero no todo va a ser tan bonito, se observa a la vez que el
mutante crece a un ritmo más lento que el nativo.
Se sabe que la cantidad de
glucosa en el medio es el factor limitante para la producción de etanol, por lo
que deciden hacer una mejora en el sistema anterior de cultivo, alimentándolo
con glucosa y evitar así el agotamiento de este sustrato. Con este método se
observa que el crecimiento del microorganismo es más lento, pero que produce
más etanol y además aumenta el rendimiento (es decir, la cantidad de etanol
generado por la cantidad de glucosa consumida).
Se decide probar también la
producción de etanol partiendo de otro de las clases de azúcares que os
mencioné al principio, una pentosa, en este caso, la xilosa haciéndose un
cultivo “batch”. Se observó que el consumo de este azúcar es más lento, pero se
obtiene una producción mayor de etanol que en el “batch” de glucosa, pese a
presentar una productividad menor (cantidad de producto por el volumen y el
tiempo que tarda en generarlo).
Así que, como podemos ver,
gracias a este método tan novedoso, aplicando una técnica tan de vanguardia
como la del ClosTron conseguimos aumentar la producción de un metabolito tan
interesante como el etanol, reduciendo la producción de otras sustancias que no
resultan menos interesantes, el butanol, en este caso, sola y exclusivamente
quitándonos un gen de por medio.
Fuentes: Switching Clostridium
acetobutylicum to an ethanol producer by disruption of the butyrate/butanol
fermentative pathway. Dörte Lehmann, Tina Lüke.Eversloh. Metabolic engineering (2011)
The
ClosTron: A universal gene knock-out system for the genus Clostridium. J. T. Heap et al. Journal
of Microbiological Methods (2007)
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