¡¡Syne!! Anda y súbeme una de butanol

Synechococcus elongatus

En un post anterior (éste) hablaba de la producción de un biocombustible como es el etanol, pues bien en este otro hablaremos de otro: el 1-butanol. Este compuesto se puede utilizar como base de partida para la obtención química de varios productos, pero más importante que eso es que tiene capacidad para almacenar energía y luego ser usada como combustible, ya que es muy similar a la gasolina. Para producirlo, metabólicamente hablando, hay dos formas: la ruta sintética de los 2-cetoácidos, o bien la dependiente de coenzima A (CoA). 

En este trabajo se usa una cianobacteria llamada Synechococcus elongatus y de las estrategias que he mencionado el grupo opta por la segunda ruta y, para ello, le introducen la friolera de… ¡¡5 GENES!! Estos genes son hbd, crt y adh2 del ya mencionado Clostridium acetobutylicum, el gen ter de Tremponema denticola y el gen atoB  de Escherichia coli.

Para introducir los genes a la cianobacteria se usan plásmidos que recombinan, es decir que se insertan, dentro del genoma del microorganismo. Además, para evitar que se produzcan disrupciones de genes y “daños colaterales” no deseados hay dos sitios caracterizados en los cuales se pueden llevar a cabo estos procesos inocuamente y que se conocen como “sitios neutral I” y “sitio neutral II”. Estos plásmidos, para construirse y luego ser transformados en nuestro microorganismo, se desarrollan en E. coli. Como 5 genes en un único plásmido es demasiado deciden distribuirlos en dos plásmidos diferentes, que se llamarán pEL5, que se dirigirá hacia el NSI y contendrá los genes atoB y adhE2 , y pEL14 que se dirigirá hacia el NSII y que llevará los tres restantes genes. Cada uno de los plásmidos conferirá asimismo una resistencia diferente, siendo el primero a espectinomicina y el segundo a kanamicina. Además el ter de T. denticola se modifica, añadiendo lo que se conoce como cola de polihistidinas. Esta modificación tiene como función el ser reconocida por un anticuerpo, lo que luego nos permitirá identificarla al unírselo. Para expresar estos genes se sitúan bajo promotores inducibles (es decir, la expresión se da bajo ciertas condiciones) en este caso inducibles por lactosa.

Ruta metabólica introducida

Para transformar a S. elongatus  se deja que el cultivo se esté desarrollando en fase exponencial (es decir, cuando más crece) y entonces se le añade el DNA exógeno que queremos que incorpore, dejándolo todo la noche a oscuras para que se dé a cabo la asimilación. Posteriormente, para seleccionar aquellos individuos que lo han introducido satisfactoriamente se añaden dos antibióticos que actúan como marcadores y que son la espectinomicina y la kanamicina, como ya mencionamos antes, y se siembra en placa. Cuando aparecen las colonias se “pican”, es decir, se toma parte y se analiza por PCR para ver si se ha producido la inserción de los fragmentos de interés. Una vez demostrada esta inserción se toma una de las colonias para continuar con los experimentos.

Colonias de S. elongatus en placa de Petri

El siguiente paso consiste en el cultivo en medio líquido en botellas con tapón de rosca de 250ml. Las condiciones para el cultivo son con, para que sea un cultivo aeróbico, o sin un burbujeo constante de una mezcla gaseosa de 5% CO₂/95% N₂. Cómo podemos ver, son condiciones anaeróbicas, es decir, no hay oxígeno. Para inducir la expresión de los genes se usa un reactivo conocido como IPTG, una sustancia análoga a la lactosa y que es capaz de activar la expresión de los genes situados bajo promotores inducible por el mencionado azúcar y que además presenta la ventaja de que no puede ser metabolizado como fuente de carbono, lo que hace que quede en el medio de cultivo activando la expresión.

Estudiaron la producción del 1-butanol en diferentes condiciones

• Con presencia de oxígeno y luz constante y no se observó nada de producción del mencionado biocombusible.
• Con burbujeo constante de 5 CO₂%/95% N₂ buscando la purgación de todo el oxígeno y con iluminación, produciéndose unas cantidades ínfimas de 1-butanol.
•  El siguiente paso consistió en incubar en oscuridad, además de con el que burbujeo, con esto se consigue eliminar completamente el oxígeno, ya que al no producirse la fotosíntesis no se acumula. El resultado fue que se llegaron a producir cantidades significativas de butanol.

Estos resultados hacen creer que el oxígeno es un inhibidor de la producción del alcohol. Para comprobrar esta tesis, se utilizó un reactivo llamado 3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetilurea (reconocedlo, ya echabáis de menos los nombres complicados. Bueno, pues aquí os van las siglas, desde siempre haciendo las cosas más fáciles: DCMU) que es un inhibidor del fotosistema II (PSII), bloqueando la capacidad de la cianobacteria de producir el O₂.  Este compuesto se añadió a cultivos que se sometieron a condiciones óxicas y anóxicas y con diferentes concentraciones del DCMU. La condición de oscuridad es dejó como control, sin que se añadiese el inhibidor, total, no hace falta, en oscuridad no se produce oxígeno. El resultado fue que a mayores concentraciones de DCMU en condiciones anóxicas se acumulaba mayor concentración de 1-butanol. La conclusión de esto es clara: no es la luz la que bloquea la producción del alcohol, sino la presencia de oxígeno.

Concluyendo, como podemos ver no sólo en las bacterias está el futuro de la energía, sino que las microalgas tienen mucho que decir en este campo, siendo capaces de nutrirse del CO₂ del aire, que tan contaminante se llega a considerar y darnos como resultado productos que no resultan tan interesantes como el 1-butanol. Además gracias a este artículo se va que la producción del alcohol butílico está influido para la presencia de oxígeno, por lo que el paso a nivel industrial requerirá de adaptación a dicha condición.

Fuente: Metabolic engineering of cyanobacteria for 1-butanol production form carbon dioxide. Ethan I. Lan et al. Metabolic engineering 13 (2011)

¡Hya!¡Fusión! o de cómo fusionar dos hongos (y sus respectivos metabolismos)

Uno de los mayores problemas a los que se enfrentan los ingenieros ambientales, los ingenieros químicos, los microbiólogos y demás profesionales que trabajan con residuos y contaminación, es la presencia de ciertas sustancias conocidas como recalcitrantes, es decir, difíciles de degradar. Una de estas sustancias xilano es el que aparece como parte de los residuos procedentes de los vegetales, como las maderas, y que forman parte de los conocidos como residuos lignocelulósicos. Para resolver el problema de su difícil procesado hasta ahora se hacían tratamientos químicos, caros y altamente contaminantes, pero ha aparecido una solución: el tratamiento enzimático.

Schizosaccharomyces pombe

Hay dos tipos de enzimas que atacan a los xilanos, la endo-β-xilanasas y las β-D-xilosidasas. El xilano pertenece a la familia de los polímeros, es decir, moléculas formadas por la repetición de moléculas más sencillas, conocidas como monómeros. La misión de estas enzimas consiste en dejar al descubierto los azúcares (sus monómeros) que forman el xilano para que puedan ser utilizados para ser fermentados, lo cual se conoce como sacarificación). Por tanto, nos encontramos ante un proceso, que está actualmente muy de moda conocido como sacarificación y fermentación simultánea. Además las levaduras son preferidas sobre las bacterias para trabajar en la industria por sus resistentes paredes celulares y su gran tamaño, lo que las hace más resistentes a emborr… digo al etanol.

Lentinula edodes

En este caso se decide aplicar una estrategia muy arriesgada: la fusión de protoplastos (células que no poseen pared celular). Esta técnica consiste en juntar dos células de organismos diferentes y fusionarlas, literalmente, para generar un nuevo organismo que tendrá características de ambos, como los metabolismos, que se entrelazan pudiendo degradar diferentes sustratos o generar nuevos productos. Los organismos que se deciden fusionar son por un lado la levadura Schizosaccharomyces pombey la seta (qué poco científico soy a veces) Lentinula edodes.

Esto es un pellet

Para la fusión de protoplastos se cultivaron por un lado la S. pombe durante 48 horas a 30ºC y se trataron con un extracto de un hongo productor de enzimas que rompen la pared celular. Las setas de L. edodes, por otro lado se diseccionaron hasta dejar fragmenos pequeños y se incubaron a 30ºC para que se acostumbrara a la temperatura de desarrollo de la levadura. El paso siguiente es sembrar en placa de Petri y de ahí tomar muestras, centrifugarlas por separado, para que se nos queden las células en forma de pellet  en el fondo del eppendorf. De ahí añadimos de nuevo el extracto de enzima degradadora de pared que hablamos y tratamos ambas muestras. Así es cómo se generan los protoplastos.

Comparación entre la levadura,
el hongo y el fusante

Llega el momento de hacerlos fusionar. Para ello se hace una mezcla 1:1 de los dos tipos celulares, es decir, el mismo número de células de cada especie. Se mezclan y se centrifugan de forma que quede un pellet. Se le añade una solución que contiene PEG (sé qué en vuestra cabeza está sonando lo siguiente “PEG, PEG… ¿de qué me suena?”. Pues coged, dejad el ordenador, id al baño y mirad la etiqueta del gel, o del champú… o de cualquier producto de higiene) o polietilenglicol, una sustancia que fluidiza las membranas. Tras esto se centrifuga y se siembra en un hueco que se hace en una placa con agar especial, conocido como agar de regeneración. Se añade otra capa de este agar formando una especie de sándwich de protoplastos (reconoced que queréis probarlo vosotros también). Se dejan que crezcan a 30ºC durante 2-3 días y después con un microscopio se seleccionan y se vuelven a sembrar. Se repite este ciclo diez veces, para asegurarnos que tenemos células estables, que llamaremos fusantes. Se observa que la morfología de estas células nuevas no corresponde con las anteriores, ya que parecen levaduras elongadas, pero que se unen formando pseudomicelios, como haría una hongo.

Ya tenemos nuestro nuevo organismo, y ahora lo que queremos es analizar dos cosas: por un lado la capacidad que tiene de asimilar diferentes fuentes de carbono y, por otro lado, que capacidad tiene para la síntesis de polioles. Se usaron 28 fuentes de carbono distintas en este estudio y se observó que la levadura inicial podía usar 8 de ellas, mientras que el fusante podía usar las 28. Además con 15 de ellas podía generar gases, mientras que la levadura sólo podía usar 5. Se centraron particularmente en tres fuentes de carbono: glucosa, xilano y xilosa.

·         En el caso de la glucosa se alcanzó una concentración de biomasa (la masa que presentan las células) de 20.12 g/L. Además, sorprendentemente… se produjo etanol, hasta una concentración de unos 80 g/L. También, ya que el bicho estaba por sorprender, a partir del sexto día comenzó a producir arabitol, hasta unos límites de 8.56 g/L.

·         La xilosa, por otro lado, al ser usada como fuente de carbono permitió alcanzar un nivel de biomasa de 18.23 g/L, ligeramente menor que el conseguido con glucosa. Como consecuencia del metabolismo de esta sustancia se produce xilitol, un poliol usado como edulcorante, pero tras pasar un tiempo se comienza a consumir. Por otro lado, también se produce arabitol, alcanzando valores que rondan unos 19 g/L.

Pero el punto más fuerte de este experimento es el uso de xilano, una sustancia recalcitrante como ya dije y, por tanto, difícilmente degradable. Nuestro fusante es capaz de romper estos enlaces (hidrolización) para obtener la xilosa y usarla como fuente de carbono para alimentarse. Usando esta fuente de carbono alcanza unos valores similares a los que se mencionó antes, es decir, unos 18.10-18.40 g/L. Se produce arabitol hasta alcanzar una cota de 63.78 g/L (vamos, lo que viene a ser un pasote) y de xilitol superando los 60 g/L también, pero, como todo en esta vida, no todo va a ser un campo de rosas, y obtenemos una producción nula de etanol.

Complementariamente a este último experimento se indagó si sería el fusante capaz de utilizar como fuente de carbono residuos agrícolas, como restos de maíz o de arroz, obteniendo un rendimiento similar al anteriormente mencionado

Concluyendo… este bicho, este híbrido interespecífico ha venido al mundo a revolucionarlo. Come de todo lo que le echen y encima, nos produce sustancias de interés, polioles. Oye, ¿qué queréis que os diga? Yo me lo quedo.

Fuente: Construction of an intergeneric fusion from Schizosaccharomyces pombe and Lentinula edodes for xylan degradation and polyol production. Cheng-Chang Lin et al. Enzyme and microbial technology (2005)

Superproducción de L-fenilalanina en B. subtilis

Quizás hayamos escuchado alguna vez el concepto “aminoácido esencial” sin saber realmente qué es eso. Pues bien, esta clase de sustancias son los aminoácidos que el propio organismo no puede sintetizar por no poseer las rutas biosintéticas que llevan hasta la producción de dicho metabolito, pero que le son necesarios. Como podemos suponer de dicho enunciado, la esencialidad o no esencialidad depende del propio organismo y no es un hecho general para toda la variedad de la vida. La única vía que tenemos para tener estas sustancias es a través de la dieta. Uno de estos aminoácidos es la L-fenilalanina, un aminoácido aromático que actúa de precursor para otro, la tirosina. ¿Cómo hacemos para obtenerlo en grandes cantidades?

La estrategia que se ha utilizado para este experimento es diferente al resto, ya que buscamos, en este caso, la sobreexpresión de una proteína en concreto. Aquí será la corismato mutasa, (en la ruta metabólica está recuadrada en verde en esta imagen) codificada por el gen aroH, presente en el propio genoma de Bacillus subtilis, entonces la pregunta es: ¿para qué hacer esto?

B. subtillis

Pues la respuesta es sencilla, la bacteria en cuestión produce bajas concentraciones de fenilalanina (Phe), así que un incremento de la actividad de una de las enzimas que lleva a la producción de este aminoácido provocará un desequilibrio de la ruta metabólica, conllevando una acumulación de la sustancia de interés. El método para hacerlo consiste en clonar el gen aroH en un plásmido multicopia (aparece en número alto de copias del mismo) lo que hará que incremente la concentración de dicha proteína.

Para hacer esto, primero es necesario obtener el ADN de B. subtilis. Para ello, se rompe la célula (se hace una lisis) partiendo de un cultivo en el que las células están en buena salud, creciendo exponencialmente. Para obtener el gen aroH se utiliza la ya mencionada PCR usando primers específicos que contienen secuencias reconocidas por las enzimas de restricción SalI y BamHI. Una vez amplificado este gen se introduce en un plásmido, llamado pUC19, gracias a las dos enzimas de restricción anteriormente mencionadas, para poder mantenerlo en E. coli que se manifestará por el desarrollo de la resistencia al antibiótico ampicilina. El método de transformación es la coprecipitación con CaCl_2, esta sustancia se une al ADN cargado negativamente y lo acerca al núcleo del lipopolisacárido (estos son parte de la pared celular bacteriana, que actúa como protección), lo que permite que cuando le demos un golpe de calor a la bacteria pase al interior celular y se lleve a cabo la transformación. Para poder después transformarlo en B. subtilis, usando las mismas enzimas de restricción, que usamos en nuestra bacteria de interés recurrimos a un sistema conocido como “shuttle vector” o vector lanzadera, llamado pMK4, el cual nos permitirá el cultivo en los dos microorganismos, además podremos seleccionar resistentes a dos antibióticos, la ampicilina y el cloranfenicol. Para transformar al bacilo se usa la electroporación que ya mencioné en el post anterior. La ventaja que presenta tenerlo en un plásmido multicopia, como es el caso, es que va a aparecer un mayor número del gen, lo que hará que también sea mayor la concentración de la proteína. 

E. coli

Se sabe que la fenilalanina inhibe en gran medida su propia producción, ya que inhibe a una enzima que responde al nombre de 3-desoxi-D-arabinoheptulosa-7-fostafo sintasa, que es la primera enzima que desvía desde la rama principal hacia la síntesis de aminoácidos aromáticos. Si quieres ver la ruta, pincha aquí. Para evitar esta inhibición, se alimentó a las células con dos metabolitos intermedios de la ruta y que están justo antes de esta enzima, de tal forma que el equilibrio químico queda desplazado, evitando que se produzca la inhibición. Estas sustancias son eritrosa-4-fostato y fosfoenolpiruvato (no es quejaréis, ¿eh? Que estas son facilitas). De hecho se observa que al alimentar con estos dos reactivos aumenta la concentración varias veces.

Ahora bien, en E. coli y en B. subtilis este aumento de la producción de fenilalanina es diferente. En el primero microorganismo se da una duplicación de la producción, menor que en el bacilo porque presenta 3 diferentes DHAP sintasas, cada una sujeta a inhibición por un aminoácido diferente, siendo casi 3 veces superior la producción de éste.

Con estos resultados, hemos visto que es posible aumentar la producción de uno de los aminoácidos, pero ya teniendo este nodo controlado… ¿quién sabe si en un futuro no muy lejano podamos maximizar la producción de los otros dos aminoácidos aromáticos, la tirosina y el triptófano?

P.d. si abrís la imagen veréis que es una maraña, además, lo más divertido es que en el artículo la llaman la “ruta simplificada”, qué cachondos…

Metabolic engineering of aromatic group amino acid pathway in Bacillus subtilis for L-phenylalanine production I.S. Özçelik et al.  Chemical Engineering Science (2004)